Un procedimiento de detección de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) en un mamífero,

que comprende detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido LY6 (a) en una muestra de ensayo de tejido inflamado o células obtenidas del tracto gastrointestinal de dicho mamífero, y (b) en una muestra del control, en la que un nivel de expresión mayor del ácido nucleico o polipéptido LY6 en la muestra de ensayo, en comparación con la muestra del control, es indicadora de la presencia de IBD en el mamífero a partir del cual se obtuvo la muestra de ensayo.

Procedimientos para detectar la enfermedad inflamatoria del intestino

CAMPO DE LA INVENCIÓN

La presente invención se refiere a perfiles de expresión génica en la patogénesis de la enfermedad inflamatoria del intestino. Este descubrimiento encuentra uso en la detección y diagnóstico de la enfermedad inflamatoria del intestino

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

La enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) , un trastorno inflamatorio crónico del tracto intestinal padecido por aproximadamente un millón de pacientes en los Estados Unidos, se compone de dos grupos de enfermedades principales: colitis ulcerosa (UC) y enfermedad de Crohn (CD) . En ambas formas de IBD, los microbios intestinales pueden iniciar la enfermedad en individuos genéticamente susceptibles. La UC está restringida a menudo al colon, mientras que la CD se produce normalmente en el íleo del intestino delgado y en el colon. (Podolsky, D.K., N. Engl. J. Med. 347:417-429 (2002) . Los perfiles de expresión génica de tejidos de pacientes de IBD han proporcionado algunas evidencias de las posibles dianas para la terapia y/o el diagnóstico (véanse, por ejemplo, Dieckgraefe, B.K. y col., Physiol. Genomics 4: 1-11 (2000) ; Lawrance I.C. y col., Hum Mol Genet. 10: 445-456 (2001) ; Dooley T.P. y col., Inflamm. Bowel Dis. 10: 1-14 (2004) ; y Uthoff S.M., Int J Oncol. 19: 803-810 (2001) ) . Investigaciones adicionales de la desregulación génica en pacientes que experimentan la enfermedad inflamatoria del intestino incluyen, por ejemplo, Lawrance, I.C. y col., cuyos perfiles de expresión génica distintivos se dieron a conocer para algunos genes en la UC y la CD (Lawrance, I.C. y col., Human Mol. Genetics 10 (5) : 445-456 (2001) ) . Uthoff, S.M.S. y col., han dado a conocer la identificación de genes candidatos para la UC y la CD usando el análisis de la micromatriz (Uthoff, S.M.S. y col., Int'l. J. Oncology 19: 803-810 (2001) . Dooley, T.P. y col. han dado a conocer la correlación de la expresión génica en la IBD con tratamiento con fármacos para el trastorno (Dooley, T.P. y col., Inflamm. Bowel Dis. 10 (1) : 1-14 (2004) .

Existe la necesidad de identificar marcadores biológicos adicionales de la enfermedad inflamatoria del intestino para uso en el diagnóstico de esta enfermedad crónica. La presente divulgación cubre esta necesidad.

RESUMEN DE LA INVENCIÓN

Se da a conocer en la presente memoria descriptiva el hallazgo único de que los miembros de la superfamilia de genes LY6 están regulados en exceso en la superficie de las células epiteliales intestinales (IEC) en modelos de colitis de murino y en tejido intestinal de pacientes humanos que experimentan IBD, cuyos genes no se expresan en IEC sanas. La mayoría de los miembros de la familia LY6 son glicoproteínas superficiales celulares ancladas por GPI con una amplia distribución en células de origen hematopoyético y una expresión más limitada en células no hematopoyéticas. Aunque ampliamente usados como marcadores de diferenciación de células inmunes (Sunderkotter, C. y col., J. Immunol. 172: 4410-4417 (2004) ) , las funciones que la familia LY6 posee han sido difíciles de elucidar (Shevach, E.M. y P.E. Korty, Immunol. Today 10: 195-200 (1989) ) . Los informes han demostrado que las moléculas LY6 están implicadas en una gama diversa de funciones que incluyen la activación de linfocitos T (Zhang, Z.X. y col., Eur. J. Immunol. 32: 1584-1592 (2002) y Henderson, S.C. y col., J. Immunol. 168: 118-126 (2002) , olfato (Chou, J.H. y col., Genetics 157: 211-224 (2001) y adhesión celular (Jaakkola, I. y col., J. Immunol.

170: 1283-1290 (2003) ) .

En el sentido más amplio, la invención proporciona un procedimiento de detección del aumento de expresión de genes de la familia de genes LY6 humanos en células o tejido gastrointestinal inflamado procedente de un primer mamífero que experimenta enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) con respecto a un mamífero del control. En un sentido más directo, se espera que el procedimiento sea aplicable al diagnóstico de la IBD, IBD asociada con la expresión de LY6H, LYPD1, LYPD3, y LYPD5, tal como colitis ulcerosa (UC) y Enfermedad de Crohn (CD) . El procedimiento de a invención es útil para detectar respondedores y no respondedores a tratamiento terapéutico de la IBD. En una posible realización, la IBD es colitis ulcerosa (UC) . La IBS puede ser Enfermedad de Crohn (CD) . En una realización, el tejido gastrointestinal es tejido de colon tal como colon sigmoideo. En una realización, la expresión génica de LY6H, LYPD1, LYPD23 y/o LYPD5 aumenta en tejido gastrointestinal (tal como tejido de colon) en una IBD, CD o UC. En una realización, el gen LY6H comprende el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 1 y codifica el polipéptido de LY6H que comprende la SEQ ID NO: 2. En una realización, el gen LYPD1 comprende el ácido nucleico de las SEQ ID NOS: 3 o 4 y codifica el polipéptido LYPD1 que comprende la SEQ ID NO: 5. En una realización, el gen LYPD3 comprende el ácido nucleico de la SEQ ID NO: 6 y codifica el polipéptido LYPD3 que comprende la SEQ ID NO: 7. En una realización, el gen LYPD5 comprende el ácido nucleico de las SEQ ID NOS: 8 o 9 y codifica el polipéptido LYPD5 que comprende la SEQ ID NO: 10.

En una realización, el procedimiento de la invención comprende obtener una muestra de tejido gastrointestinal procedente de un mamífero de prueba sospechoso de experimentar un trastorno intestinal, poner en contacto el tejido con un agente detectable que interactúa con la proteína LY6H, LYPD1, LYPD3 y/o LYPD5 o con ácido nucleico que codifica LY6H, LYPD1, LYPD3 y/o LYPD5 y determinar el nivel de expresión de LY6H, LYPD1, LYPD3 y/o LYPD5 con respecto a un tejido de control. En una realización, el aumento de expresión de LY6H, LYPD1, LYPD3 y/o LYPD5 con respecto al control es indicativo de IBD en el mamífero de prueba. En una realización, el aumento de expresión de LY6H, LYPD1, LYPD3 y/o LYPD5 en el tejido gastrointestinal de prueba con respecto al tejido gastrointestinal de control es indicativo de UC en el mamífero de prueba. En una realización, el tejido o las células procedentes de la prueba y del mamífero del control son del colon.

En una realización, la expresión de LY6H, LYPD1, LYPD3 y/o LYPD5 se determina mediante la detección de la expresión génica, tal como mediante la detección del ARNm que codifica LY6H, LYPD1, LYPD3 y/o LYPD5 en una muestra de tejido o células procedente del tracto gastrointestinal. En una realización, una muestra del control es una muestra de tejido o células del mismo tejido o tipo de células obtenidos de un mamífero conocido que no está experimentando un trastorno gastrointestinal, tal como IBD, UC o CD. En una realización, una muestra del control es un patrón universal que comprende ARN procedente de algunos tejidos normales o de múltiples líneas celulares. En análisis de micromatrices, tales patrones universales son útiles para vigilar y controlar la variación intra e interexperimental. En una realización, un patrón universal (o ARN de Referencia Universal (URR) se prepara tal como se proporciona por Novoradovskaya, N. y col., (2004) BMC Genomics 5: 20. En una realización, para uso como un control en el análisis de la micromatriz de ARN de ratón, el URR es un ARN de Referencia de Ratón Universal de Stratagene (nº de catálogo 740100, Stratagene®, La Jolla, CA.) . En una realización, para uso como un control en un análisis de micromatriz de ARN humano, el URR es un ARN de Referencia Humano Universal de Stratagene® (nº de catálogo 740000) . En una realización, para uso como un control en el análisis de la micromatriz de ARN de rata, el URR es un ARN de Referencia de Rata Universal de Stratagene® (nº de catálogo 740200) . En una realización, en la que el ARN es ARN de ratón, las líneas celulares de las cuales se extrae el ARN total comprenden líneas celulares derivadas de embriones, fibroblastos de embriones, riñón, hepatocitos de hígado, macrófagos alveolares de pulmón, linfocitos B, linfocitos T (timo) , glándulas mamarias, mioblastos de músculos, piel, y testículos. En una realización, en la que el ARN es ARN humano, las líneas celulares de las cuales se extrae el ARN total comprenden líneas celulares derivadas de adenocarcinoma de glándula mamaria, hepatoblastoma de hígado, adenocarcinoma de cuello de útero, carcinoma embriónico o de testículos, glioblastoma de cerebro, melanoma, liposarcoma, linfoma histiocítico (macrófagos, histiocitos) , leucemia linfoblástica de linfoblastos T, melanoma plasmacitoma de linfocitos B. En una realización en la que el ARN es ARN de rata, las líneas celulares de las cuales se extrae... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de detección de la enfermedad inflamatoria del intestino (IBD) en un mamífero, que comprende detectar el nivel de expresión de un gen que codifica un polipéptido LY6 (a) en una muestra de ensayo de tejido inflamado o células obtenidas del tracto gastrointestinal de dicho mamífero, y (b) en una muestra del control, en la que un nivel de expresión mayor del ácido nucleico o polipéptido LY6 en la muestra de ensayo, en comparación con la muestra del control, es indicadora de la presencia de IBD en el mamífero a partir del cual se obtuvo la muestra de ensayo.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tejido o las células de la muestra de ensayo son del colon del mamífero.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el tejido o las células de la muestra de ensayo son del íleo terminal del mamífero.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la muestra del control es una muestra de un tejido o células normales sin IBD del mismo origen o tipo de tejido, o múltiples muestras de tejido o células sin IBD del mismo origen o tipo de tejido, los niveles de expresión del cual están promediados, o un control universal que representa la expresión del gen en múltiples muestras de tejido normal sano de la misma especie.

5. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con un agente detectable que se une específicamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido LY6 o uno de sus fragmentos; (b) poner en contacto la muestra del control con el agente detectable; y (c) detectar la formación de un complejo entre el agente y el polinucleótido de la muestra de ensayo y la muestra del control, en el que la formación de menos complejo en la muestra de ensayo con respecto a la muestra del control es indicadora de la presencia de IBD en el mamífero; en el que opcionalmente, el procedimiento es el ensayo de hibridación in situ o el ensayo de reacción en cadena de la polimerasa en tiempo real (RT-PCR) .

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el polinucleótido comprende la secuencia de ácido nucleico de la SEQ ID NO: 8, 9, 1, 3, 4, 6, o uno de sus fragmentos que comprende al menos 15 nucleótidos contiguos de la SEQ ID NO: 8, 9, 1, 3, 4, o 6.

7. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el agente es un segundo polinucleótido que se hibrida a un polinucleótido que tiene la secuencia SEQ ID NO: 8, 9, 1, 3, 4, 6 o su complemento.

8. El procedimiento de la reivindicación 7, en el que el segundo polinucleótido comprende una marca detectable o unida a un soporte sólido, en el que la marca detectable es directamente detectable o indirectamente detectable, y opcionalmente, en el que la marca detectable es una marca fluorescente.

9. El procedimiento de una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende:

(a) poner en contacto la muestra de ensayo con un agente detectable que se une específicamente a un polinucleótido que codifica el polipéptido LY6 o uno de sus fragmentos; (b) poner en contacto la muestra del control con el agente detectable; y (c) detectar la formación de un complejo entre el agente y el polinucleótido de la muestra de ensayo y la muestra del control, en el que la formación de menos complejo en la muestra de ensayo con respecto a la muestra del control es indicadora de la presencia de IBD en el mamífero.

10. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el polipéptido LY6 comprende la SEQ ID NO: 10, 2, 5

o 7 o uno de sus fragmentos que comprende al menos 10 aminoácidos contiguos de la SEQ ID NO: 10, 2, 5 o 7.

11. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el agente es un anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión, en el que opcionalmente el anticuerpo o uno de sus fragmentos de unión comprende una marca detectable, en el que la marca detectable es directamente detectable o indirectamente detectable, y en el que opcionalmente la marca detectable es una marca o una radiomarca fluorescente.

12. El procedimiento de la reivindicación 1, la reivindicación 5 o la reivindicación 9, en el que la muestra de ensayo de tejido o células es de un mamífero sospechoso de experimentar IBD.

13. El procedimiento de la reivindicación 1, la reivindicación 5, o la reivindicación 9, en el que la muestra de ensayo de tejido o células es de un mamífero sospechoso de experimentar UC.

14. El procedimiento de la reivindicación 1, la reivindicación 5, o la reivindicación 9, en el que los tejidos o las células del mamífero se han puesto en contacto con un agente terapéutico, y en el que el nivel de expresión de LY6 es indicador de la presencia o ausencia de una respuesta al agente terapéutico en el tejido o las células del mamífero.

15. El procedimiento de la reivindicación 1, la reivindicación 5, o la reivindicación 9, en el que los tejidos o las células del mamífero se han puesto en contacto con un agente terapéutico, en el que la detección es una detección segunda o posterior, y en el que el nivel de expresión de LY6 es indicador de la presencia o ausencia de una respuesta al agente terapéutico en el tejido o las células del mamífero.

16. El procedimiento de la reivindicación 1, la reivindicación 5, o la reivindicación 9, en el que el aumento en la expresión de LY6 en la muestra de ensayo es al menos de 1, 5 veces, al menos de 2 veces, al menos de 3 veces, al menos de 5 veces, al menos de 6 veces, al menos de 7 veces, al menos de 8 veces, al menos de 9 veces, o al menos de 10 veces más que la muestra del control. 10