Procedimientos de producción recombinante de glucoproteínas.

Un procedimiento de aumento del porcentaje de oligosacáridos que terminan en ácido siálico en glucoproteínas producidas de manera recombinante que comprende inhibir la expresión y/o la actividad de la sialidasa en un cultivo de células recombinantes, en el que la inhibición de la expresión y/o la actividad de la sialidasa comprende la adición de una cantidad eficaz de factor de crecimiento de tipo insulina 1

(IGF-1) al cultivo de células recombinantes.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2009/039633.

Solicitante: BAYER HEALTHCARE LLC.

Nacionalidad solicitante: Estados Unidos de América.

Dirección: 100 Bayer Boulevard Whippany, New Jersey 07981-0915 ESTADOS UNIDOS DE AMERICA.

Inventor/es: WANG,Jin, WANG,FRANK S.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/04 (Péptidos o polipéptidos cíclicos o puenteados, p. ej. bacitracina (ciclados solamente por enlaces — S — S — C12P 21/02))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas... > C07K17/00 (Péptidos fijados sobre un soporte o inmovilizados; Su preparación)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/06 (preparados por hidrólisis de un enlace peptídico, p. ej. hidrolizados)

PDF original: ES-2517603_T3.pdf

 

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Ilustración 1 de Procedimientos de producción recombinante de glucoproteínas.
Ilustración 2 de Procedimientos de producción recombinante de glucoproteínas.
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Procedimientos de producción recombinante de glucoproteínas.

Fragmento de la descripción:

Procedimientos de producción recombinante de glucoproteínas Campo de la invención

La invención se refiere a procedimientos de producción recombinante de glucoproteínas en cultivo de células eucariotas. Se proporcionan procedimientos para mejorar el patrón de glucosilación en glucoproteínas producidas de forma recombinante mediante el aumento del porcentaje de oligosacáridos que terminan en ácido siálico.

Antecedentes

Las glucoproteínas se refieren, en general, a péptidos y proteínas que tienen más de aproximadamente diez aminoácidos y al menos una cadena lateral de oligosacáridos. La composición de hidratos de carbono de un oligosacárido unido puede afectar a la solubilidad, la actividad biológica, la resistencia a la degradación por proteasas y la circulación in vivo de una glucoproteína. Los restos terminales de glucanos son particularmente importantes para las proteínas terapéuticas, pues el resto de azúcar final suele controlar su semivida en circulación in vivo. Por lo general, las glucoproteínas con oligosacáridos que terminan en ácido siálico permanecen en circulación más tiempo debido a la presencia de receptores en los macrófagos y los hepatocitos que se unen y degradan rápidamente las estructuras que terminan en otros azúcares/am i no-azúcares del torrente sanguíneo.

Se ha encontrado que los iones de cobre (Cu2+) pueden aumentar la protección de ácido siálico (véase la patente de EE.UU. N2 6.528.286 concedida a Ryll). Sin embargo, también se sabe que las células eucariotas han demostrado ser sensibles a la concentración de Cu2+ en los medios de cultivo. Por lo tanto, existe la necesidad de proporcionar una alternativa más segura a los Cu2+ para aumentar la protección de ácido siálico de las glucoproteínas.

Por consiguiente, en el presente documento, se proporcionan procedimientos y procesos para aumentar el porcentaje de oligosacáridos que terminan en ácido siálico con el fin de prolongar la semivida de la glucoproteína.

Descripción de las figuras

La Figura 1 muestra la metodología usada para el cálculo del porcentaje de protección de las glucoproteínas. La Figura 1 (A) es un diagrama de una proteína que ha sido glucosilada, parte de la cual se ha protegido mediante ácido siálico. La Figura 1 (B) muestra un diagrama de flujo del procedimiento usado para calcular la protección de ácido siálico. La Figura 1 (C) muestra la fórmula usada para el porcentaje de protección.

La Figura 2 representa un gráfico que muestra las tendencias de protección de la glucoproteína recombinante K en campañas de fabricación a escala comercial.

La Figura 3 representa un gráfico que muestra la actividad de la sialidasa de lisado celular de campañas de fabricación a escala comercial.

La Figura 4 representa gráficos que muestran la actividad de la sialidasa de una fuente de células de baja protección y una fuente de células de alta protección durante la fermentación en un biorreactor de 15 I. La Figura 4(A) muestra la actividad de la sialidasa libre en el sobrenadante. La Figura 4(B) muestra la actividad de la sialidasa en lisados celulares.

La Figura 5 proporciona un diagrama de la vía de señalización del factor de crecimiento similar a la insulina 1 (IGF-1) y del receptor de la insulina.

La Figura 6 representa que la regulación de la sialidasa es mediada por la vía del IGF-1/receptor de insulina. La Figura 6(A) es una inmunotransferencia de Akt fosforilada. La Figura 6(B) es una inmunotransferencia de Erk fosforilada. La Figura 6(C) es un gráfico que muestra actividad de la sialidasa intracelular con diferentes inhibidores.

La Figura 7 muestra el efecto de la insulina y del IGF-1 en la expresión de la sialidasa. La Figura 7(A) es una inmunotransferencia de la sialidasa. La Figura 7(B) es un gráfico que muestra células BHK con actividad de la sialidasa intracelular cultivadas en medios con insulina, medios con nivel reducido de insulina (1/1 de la concentración) y medios con un nivel reducido de insulina + IGF-1.

La Figura 8 muestra que la actividad de la sialidasa en células BHK depende del pH.

La Figura 9 representa un gráfico que muestra la inhibición de la actividad de la sialidasa usando oligoelementos, incluyendo CaCI2, N¡CI2, CoCI2y ZnCI2.

Sumario

Se proporcionan procedimientos y procesos de producción de glucoproteínas mediante el cultivo de células eucariotas que proporcionan un producto glucoproteico que contiene oligosacáridos que terminan en uno o más

restos siálicos. Los procedimientos de cultivo celular descritos en el presente documento permiten la recuperación de un producto glucoproteico cuyos oligosacáridos no se ven comprometidos por las degradaciones asociadas con los procedimientos de cultivo celular convencionales. Los procedimientos descritos en el presente documento resuelven el problema de la desialilación de las cadenas laterales de oligosacáridos de una glucoproteína que están asociados con los procedimientos de producción de glucoproteínas convencionales. La invención proporciona beneficios económicos y comerciales a través de la recuperación de mayores cantidades útiles de producto glucoproteico.

Por consiguiente, se proporcionan procedimientos de producción de glucoproteínas mediante el cultivo de células eucariotas y, especialmente, de mamífero que comprenden cultivar una célula huésped que expresa una glucoproteína en presencia de iones de cinc o cobalto en un medio de cultivo celular a una concentración eficaz para reducir al mínimo la pérdida de ácido siálico de los oligosacáridos. Por tanto, la presente invención proporciona diversos procedimientos de cultivo celular para conservar determinadas glucoformas de glucoproteínas producidas en cultivo de células de mamíferos. En algunas realizaciones, los iones de cinc o cobalto se administran al medio de cultivo celular o al Usado celular a niveles suficientes para inhibir la actividad de la sialidasa.

En algunas realizaciones, se proporcionan procedimientos o procesos de producción de una glucoproteína en cultivo de células de mamífero mediante la adición de una cantidad eficaz de Co2+ a un medio de cultivo en el que se cultivan células que producen la glucoproteína. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es suficiente para inhibir la expresión y/o la actividad de la sialidasa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la concentración de Co2+ es de entre aproximadamente ,5 mM y 5 mM. El parámetro anterior se controla para afectar al contenido de ácido siálico de la glucoproteína madura. En algunas realizaciones, el Co2+ se obtiene de una sal de cobalto. En algunas realizaciones, el Co2+ se obtiene de compuestos seleccionados del grupo que consiste en CCI2 y CSO4.

La presente invención proporciona, en algunas realizaciones, procedimientos o procesos de producción de una glucoproteína en cultivo de células de mamífero mediante la adición de una cantidad eficaz de Zn2+ a un medio de cultivo en el que se cultivan células que producen la glucoproteína para inhibir la expresión y/o la actividad de la sialidasa. En algunas realizaciones, la cantidad eficaz es suficiente para inhibir la expresión y/o la actividad de la sialidasa. Por lo tanto, en algunas realizaciones, la concentración de Zn2+ es de entre aproximadamente ,5 mM y 5 mM. El parámetro anterior se controla para afectar el contenido de ácido siálico de la glucoproteína madura. En algunas realizaciones, el Zn2+ se obtiene de una sal de cinc. En algunas realizaciones, el Zn2+ se obtiene de compuestos seleccionados del grupo que consiste en ZnCb y ZnS4.

En algunas realizaciones, también se proporcionan procedimientos o procesos de producción de una glucoproteína en un cultivo de células de... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de aumento del porcentaje de oligosacáridos que terminan en ácido siálico en glucoproteínas producidas de manera recombinante que comprende inhibir la expresión y/o la actividad de la sialidasa en un cultivo de células recombinantes, en el que la inhibición de la expresión y/o la actividad de la sialidasa comprende la adición

de una cantidad eficaz de factor de crecimiento de tipo insulina 1 (IGF-1) al cultivo de células recombinantes.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la inhibición de la expresión y/o la actividad de la sialidasa comprende además la adición de una cantidad eficaz de ion de cinc, ion de cobalto o ambos al cultivo de células recombinantes.

3. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el ion de cinc o el ion de cobalto tiene una concentración de 1 entre ,5 mM y 5 mM.

4. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el ion de cinc se añade en forma de una sal de cinc.

5. El procedimiento de la reivindicación 4, en el que la sal de cinc está seleccionada del grupo que consiste en ZnCh y ZnS4.

6. El procedimiento de la reivindicación 2, en el que el ion de cobalto se añade en forma de una sal de cobalto.

7. El procedimiento de la reivindicación 6, en el que la sal de cobalto está seleccionada del grupo que consiste en

CCI2 y CSO4.

8. El procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 2-7, que comprende además modificar el pH del cultivo celular.

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que el pH es de 7, o inferior.

1. El procedimiento de la reivindicación 9, en el que el pH es de 6,5 a 7,.

11. El procedimiento de la reivindicación 11, en el que el IGF-1 tiene una concentración de entre 1 y 9 ng/ml.