Una composición que comprende un polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada,

en la que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 o a la asparagina 34 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado, para su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmune mejorada en un cerdo contra un antígeno del Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VSRRP)

Procedimientos y composiciones para la vacunación de animales con antígenos de VSRRP con una inmunogenicidad mejorada.

Declaración en Relación con una Investigación o Desarrollo Financiado por el Gobierno Federal de los Estados Unidos

La presente invención se realizó con financiación del Gobierno de los Estados Unidos de acuerdo con la National Research Initiative Competitive Grant Nº 2004-01576 del Departamento de Agricultura de los Estados Unidos y de acuerdo con el programa COBRE del Instituto Nacional de la Salud del National Center for Research Resources Proyect Nº P20RR15636. El gobierno tiene ciertos derechos respecto a la presente invención.

Antecedentes de la invención

La presente invención se refiere en general a composiciones que comprenden antígenos del Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VSRRP) con una inmunogenicidad mejorada y a procedimientos para su uso. Las composiciones y procedimientos descritos en el presente documento dan como resultado respuestas inmunogénicas mejoradas de cerdos a antígenos de VSRRP, proporcionando de este modo una protección mejorada de los cerdos frente a la infección por VSRRP.

El VSRRP es un patógeno económicamente importante que afecta a cerdos. La infección de cerdas multíparas y cerdas nulíparas con VSRRP puede dar como resultado el fracaso reproductivo. El VSRRP también causa enfermedades respiratorias en cerdos de todas las edades. Es posible vacunar a los cerdos para protegerlos de la infección por VSRRP. Sin embargo, las vacunas actuales disponibles en el mercado (siendo la mayoría vacunas vivas atenuadas) son algo ineficaces y por lo tanto deberían mejorarse. Los mecanismos inmunológicos completos de la protección frente al VSRRP no están claros; sin embargo, se ha demostrado claramente que los anticuerpos neutralizantes contra VSRRP son fundamentales para esta protección. Desgraciadamente, el propio VSRRP (en su forma de tipo silvestre) o las vacunas vivas actuales obtenidas a partir del mismo tienen una escasa capacidad para inducir anticuerpos neutralizantes específicos de virus de una forma oportuna y a niveles eficaces (es decir, protectores).

La Patente de Estados Unidos Nº 6.500.662, "Infectious cDNA clone of North American porcine reproductive and respiratory syndrome (SRRP) virus and uses thereof" (por Calvert y col., 31 de diciembre, 2002) describe el desarrollo de un clon de ADNc de VSRRP norteamericano infeccioso y su uso como vacuna. Sin embargo, la Patente de Estados Unidos Nº 6.500.662 no desvela vacunas de VSRRP que comprendan antígenos de VSRRP hipoglicosilados.

En otro estudio, se compararon secuencias de la proteína GP5 (o proteína de la ORF5) de diversas cepas de VSRRP norteamericano entre sí y con el aislado de VSRRP europeo representativo conocido como la cepa Lelystad, poniendo de manifiesto que los sitios de glicosilación ligada a N en la Asparagina 44 (N44) y la Asparagina 51 (N51) de la secuencia consenso de GP5 estaban conservados en todos los aislados de VSRRP examinados (Pirzadeh y col., Can. J. Vet Res., 1998, 62: 170-177). Sin embargo, el sitio de N-glicosilación localizado en la Asparagina 31 (N31) de la secuencia consenso de GP5 estaba ausente en ciertos aislados de VSRRP norteamericanos y estaba ausente en el aislado de la cepa Lelystad de VSRRP europeo. Se produjeron proteínas de fusión recombinantes GST-GP5 de cuatro (4) cepas de VSRRP norteamericano y de la cepa Lelystad en E. coli como cuerpos de inclusión insolubles, se renaturalizaron y se usaron como inmunógenos en conejos. Dichas proteínas recombinantes producidas en E. coli conservan pero no glicosilan sus sitios de N-glicosilación nativos.

También se ha demostrado que la inoculación de cerdos con una vacuna de ADN que comprende la fusión de un promotor de CMV con el gen de GP5 del aislado de VSRRP norteamericano IAF-Klop proporciona protección en animales inmunizados frente a la exposición a VSRRP (Pirzadeh y Dea, 1998, J. General Virology, 79, 989-999). Este aislado de gen de GP5 particular codifica una proteína GP5 que contiene los restos Asparagina N31, N44 y N51 que presumiblemente están glicosilados cuando se expresan en cerdos inmunizados con la vacuna de ADN. La vacunación de cerdos con GST-GP5 producida en E. coli, que conserva pero no glicosila los sitios de N-glicosilación nativos del gen de GP5 de la cepa IAF-Klop, no protegía los pulmones de los cerdos expuestos a virus.

También se han descrito clones infecciosos de VSRRP europeo que contienen mutaciones que dan como resultado la expresión de proteínas de VSRRP hipoglicosiladas (Wissink y col., 2004, J. Gen. Virol. 85: 3715-23). Esta referencia particular informa de que los VSRRP que contienen mutaciones en el resto Asparagina 53 (N53) de la proteína GP(5) de la cepa Lelystad de VSRRP, que impiden la glicosilación ligada a N de ese sitio, son infecciosos y pueden producir partículas de virus de la cepa Lelystad de VSRRP infecciosas. Por el contrario, los VSRRP que contienen mutaciones en la N46 de la proteína GP(5) de la cepa Lelystad de VSRRP, que impiden la glicosilación ligada a N de ese sitio, no son infecciosos y no producen partículas de virus de la cepa Lelystad de VSRRP infecciosas. Wissink y col. especulan que los sitios de N-glicanos en la proteína GP_2a del VSRRP europeo y, por analogía, el sitio N53 de la proteína GP5, podrían actuar a muchos niveles diferentes en el huésped natural, incluyendo interacciones con receptores o protección frente al sistema inmune. Kwang y col. (Research in Veterinary Science, vol. 67, nº 2, 1 de enero de 1999) desvelaron respuestas inmunes celulares y humorales después de procedimientos de inmunización con ADN usando las ORF 4, 5, 6 y 7 del virus SRRP. Plagemann y col. (Archives of Virology, vol. 147, 1 de enero de 2002) desvela que un epítope neutralizante de GP5 de VSRRP estaba localizado en un sitio asociado con la unión de N-glicanos y que el sitio estaba conservado entre aislados europeos y norteamericanos.

En virus distintos del VSRRP, se ha implicado a los restos de glicanos en una diversidad de papeles. La glicosilación ligada a N, en general, es importante para un plegamiento, direccionamiento y actividad biológica correctos de las proteínas (Helenius, A. y M. Aebi., Annu. Rev. Biochem. 73: 1019-1049, 2004; Williams, D. B. y Glycoconj J., 12: iii-iv, 1995; Zhang, y col. Glycobiology 14: 1229-46, 2004). En muchos virus con envoltura, las proteínas de la envoltura se modifican por adición de restos de azúcares y la glicosilación ligada a N de proteínas de la envoltura desempeña diversas funciones de glicoproteínas virales tales como unión a receptor, fusión de membrana, penetración en células y gemación de virus (Braakman, I. y E. van Anken, Traffic 1: 533-9, 2000; Doms y col. Virology 193: 545-62, 1993). Estudios recientes han demostrado el papel de la glicosilación ligada a N de la glicoproteína de virus Hantaan en el plegamiento de proteínas y el transporte intracelular (Shi, X. y R. M., Elliott, J. Virol. 78: 5414-22, 2004), así como en la actividad biológica y la antigenicidad de la proteína hemaglutinina (HA) de virus influenza (Abe, Y., y col., J. Virol. 78: 9605-11, 2004). Además, se ha hecho evidente que la glicosilación de proteínas de la envoltura viral es un mecanismo principal para la evasión del sistema inmune y la persistencia usado por varios virus con envoltura diferentes para escapar, bloquear o minimizar la respuesta de anticuerpos neutralizantes de virus. Se ha informado de ejemplos de este efecto para el VIS (Reitter, J. N. y col., Nat. Med. 4: 679-84, 1998) y el VIH-1 (Wei, X. y col., Nature 422: 307-12, 2003), el VHB (Lee, J. y col. Biochem. Biophys. Res. Commun. 303: 427-32, 2003), virus influenza (Skehel, J. J. y col., Proc. Natl. Acad. Sci. USA 81: 1779-83, 1984) y el arterivirus VLD (Chen, Z. y col. Virology 266: 88-98, 2000).

Sumario de la invención

La presente invención se desarrolló a la vista de los problemas anteriores. Se demuestra que las variantes hipoglicosiladas de una proteína de superficie principal de VSRRP GP5 aumentaba el nivel de anticuerpos neutralizantes de VSRRP producidos por cerdos inmunizados respecto a los niveles de anticuerpos neutralizantes producidos por cerdos inmunizados con GP5 de tipo silvestre (wt) o glicosilada.

La presente invención proporciona primero una composición que comprende un polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hiploglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina...

1. Una composición que comprende un polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 o a la asparagina 34 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado, para su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmune mejorada en un cerdo contra un antígeno del Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VSRRP).

2. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que cualquiera o ambos de dichos sitios de glicosilación ligada a N se inactivan por sustitución de los codones que codifican dicha asparagina 51 o dicha asparagina 34 con un codón que codifica un aminoácido distinto de asparagina.

3. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 2, en la que dicho codón que codifica otro aminoácido codifica un resto alanina o glutamina.

4. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 3, en la que dicho codón que codifica otro aminoácido codifica un resto alanina.

5. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polinucleótido comprende una molécula de ARN de VSRRP infecciosa.

6. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polinucleótido comprende una molécula de ADN que codifica una molécula de ARN de VSRRP infecciosa.

7. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 5 o la reivindicación 6, en la que dicha molécula de ARN de VSRRP infecciosa es un derivado de VSRRP europeo o un derivado de VSRRP norteamericano.

8. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polinucleótido comprende una molécula de ADN en la que un promotor activo en células de mamíferos se une operativamente a dicho polinucleótido que codifica una proteína GP5 hipoglicosilada.

9. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 8, en la que dicho promotor es un promotor de CMV.

10. La composición para su uso de acuerdo con las reivindicaciones 1 a 4, en la que dicho polinucleótido comprende un vector viral seleccionado del grupo constituido por un vector de virus vaccinia, un vector de virus herpes simple, un vector de adenovirus, un vector de alfavirus y un vector del virus de la GET.

11. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 1, en la que dicha composición comprende además un vehículo o un adyuvante terapéuticamente aceptable.

12. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicho vehículo se selecciona del grupo constituido por una proteína, un tampón, un tensioactivo y un polímero de polietilenglicol o cualquier combinación de los mismos.

13. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 11, en la que dicho adyuvante se selecciona del grupo constituido por hidróxido de aluminio, Quil A, una suspensión de gel de alúmina, aceites minerales, glicéridos, ácidos grasos, subproductos de ácidos grasos, micobacterias y oligodesoxinucleótidos CpG o cualquier combinación de los mismos.

14. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha composición se administra por inyección subcutánea, inyección intravenosa, inyección intradérmica, inyección parenteral, inyección intramuscular, inyección sin aguja, electroporación, administración por vía oral, administración intranasal, administración oronasal o cualquier combinación de las mismas.

15. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicha respuesta inmune mejorada de dicho cerdo contra un antígeno de VSRRP comprende una producción aumentada de anticuerpos neutralizantes de VSRRP por dicho cerdo.

16. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho cerdo es una cerda multípara, una cerda nulípara, un verraco o un cochinillo.

17. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en la que dicho polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada se obtiene por síntesis directa, mutagénesis de una secuencia de nucleótidos de GP5 aislada de VSRRP europeo o mutagénesis de una secuencia de nucleótidos consenso de GP5 de VSRRP europeo.

18. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 17, en la que dicha secuencia de nucleótidos de GP5 aislada de VSRRP europeo codifica una proteína GP5 que tiene una identidad de al menos el 85% con la SEC ID Nº: 15.

19. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 18, en la que dicha secuencia de nucleótidos de GP5 de VSRRP europeo es la SEC ID Nº: 15.

20. La composición para su uso de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en la que dicho polinucleótido que codifica una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada se obtiene por síntesis directa, mutagénesis de una secuencia de nucleótidos de GP5 aislada de VSRRP norteamericano o mutagénesis de una secuencia de nucleótidos consenso de GP5 de VSRRP norteamericano.

21. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en la que dicha secuencia de nucleótidos de GP5 aislada de VSRRP norteamericano codifica un péptido seleccionado del grupo constituido por las SEC ID Nº: 1, SEC ID Nº: 2, SEC ID Nº: 3, SEC ID Nº: 4, SEC ID Nº: 5, SEC ID Nº: 6, SEC ID Nº: 7, SEC ID Nº: 8, SEC ID Nº: 9, SEC ID Nº: 10, SEC ID Nº: 11, SEC ID Nº: 12 y SEC ID Nº: 13.

22. La composición para su uso de acuerdo con la reivindicación 20, en la que dicha secuencia de nucleótidos consenso de GP5 de VSRRP norteamericano codifica una proteína GP5 consenso que tiene una identidad de al menos el 85% con la SEC ID Nº: 14.

23. Una composición que comprende una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 o a la asparagina 34 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado, para su uso en un procedimiento de generación de una respuesta inmune mejorada en un cerdo contra un antígeno del Virus del Síndrome Respiratorio y Reproductivo Porcino (VSRRP).

24. Un polinucleótido aislado que codifica una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada en la que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 de una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado.

25. El polinucleótido aislado de la reivindicación 24, en el que dicho sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 se inactiva por sustitución de un codón que codifica dicha asparagina 51 con un codón que codifica un aminoácido distinto de asparagina.

26. El polinucleótido aislado de la reivindicación 24 ó 25, en el que ambos sitios de glicosilación ligada a N correspondientes a la asparagina 34 y a la asparagina 51 de la SEC ID Nº: 1 están inactivados.

27. El polinucleótido aislado de la reivindicación 26, en el que dicho sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 34 se inactiva por sustitución de un codón que codifica dicha asparagina 34 con un codón que codifica un aminoácido distinto de asparagina.

28. El polinucleótido aislado de acuerdo con la reivindicación 25 ó 27, en el que dicho codón que codifica otro aminoácido codifica un resto alanina o glutamina.

29. El polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho polinucleótido comprende una molécula de ARN de VSRRP norteamericano infecciosa.

30. El polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho polinucleótido comprende una molécula de ADN que codifica una molécula de ARN de VSRRP norteamericano infecciosa.

31. El polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho polinucleótido comprende una molécula de ADN en la que un promotor activo en células de mamíferos se une operativamente a dicho polinucleótido que codifica dicha variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada.

32. El polinucleótido aislado de la reivindicación 31, en el que dicho promotor es un promotor de CMV.

33. El polinucleótido aislado de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, en el que dicho polinucleótido comprende un vector viral seleccionado del grupo constituido por un vector de virus vaccinia, un vector de virus herpes simple, un vector de adenovirus, un vector de alfavirus y un vector del virus de la GET.

34. Una composición que comprende un polinucleótido como se define en una cualquiera de las reivindicaciones 24 a 28, y un vehículo terapéuticamente aceptable y, opcionalmente, al menos un adyuvante.

35. La composición de la reivindicación 33, en la que dicho vehículo terapéuticamente aceptable se selecciona del grupo constituido por una proteína, un tampón, un tensioactivo y un polímero de polietilenglicol, o cualquier combinación de los mimos.

36. La composición de la reivindicación 34 ó 35, en la que dicho adyuvante se selecciona del grupo constituido por hidróxido de aluminio, Quil A, una suspensión de gel de alúmina, aceites minerales, glicéridos, ácidos grasos, subproductos de ácidos grasos, micobacterias y oligodesoxinucleótidos CpG, o cualquier combinación de los mismos.

37. La composición de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 34 a 36, en la que dicha composición comprende además un segundo adyuvante que se selecciona del grupo constituido por interleucina 1 (IL-I), IL-2, IL-4, IL-5, IL-6, IL-12, interferón gamma (IFN-g), factor de necrosis tumoral, MDP (dipéptido de muramilo), complejo inmunoestimulante (ISCOM) y liposomas.

38. Una composición que comprende una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 en una proteína consenso GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado, y un vehículo terapéuticamente aceptable.

39. Un polipéptido aislado que es una variante polipeptídica de GP5 de VSRRP norteamericano hipoglicosilada, en la que al menos un sitio de glicosilación ligada a N correspondiente a la asparagina 51 en una proteína GP5 de referencia de la SEC ID Nº: 1 está inactivado.