Procedimientos y composiciones para la tolerancia al estrés en plantas.

Un procedimiento de aumento de la tolerancia tanto a la sequía como a la alta salinidad y la congelación que comprende transformar una planta con un ácido nucleico que comprende una secuencia de SEC ID Nº 6 o 7 o una secuencia con al menos el 90 % o al menos el 95 % de homología con una secuencia que comprende SEC ID Nº 6 o 7.

Procedimientos y composiciones para la tolerancia al estrés en plantas Campo de la invención

La divulgación se refiere a plantas transgénicas con tolerancia potenciada al estrés biótico y abiótico y a procedimientos de producción de tales plantas. También se desvelan secuencias de ácidos nucleicos y de péptidos aisladas.

Antecedentes de la invención

Las condiciones climáticas adversas y la actividad humana, además de agentes biológicos, son efectores del estrés para las plantas y afectan gravemente su productividad y supervivencia. La pérdida en la productividad debida a este tipo de estrés alcanza algunas veces más del 5 %. Los productores de plantas se han dedicado y se dedican a desarrollar estrategias con el fin de evitar o disminuir el impacto negativo de estas situaciones.

Entre los factores que causan estrés abiótico, la sequía, salinidad de la tierra y temperaturas extremas son algunos de los más perjudiciales. Con respecto a las temperaturas extremas, los estreses se clasifican en tres tipos: estrés por congelación (producido por temperaturas por debajo de 2C), por frío (producido por temperaturas bajas superiores a 2C) y por calor (producido por altas temperaturas). Las temperaturas frías producen daño a los tejidos fotosintéticos, inhiben el proceso fotosintético entero y el transporte de hidratos de carbono, además de la biosíntesis de proteínas y las tasas de respiración. Simultáneamente, se acelera la degradación de proteínas. Todos estos efectos se producen bastante lentamente e implican pérdida parcial o total de la funcionalidad de membranas. A diferencia, las temperaturas de congelación producen un daño rápido, matando las plantas. Se ha observado, sin embargo, que las plantas sometidas al frío durante varios días toleran las temperaturas de congelación mejor que las plantas sometidas a congelación sin haberse expuesto por primera vez a un periodo de frío; este procedimiento se llama aclimatación.

Especies tales como los cereales de invierno están adaptadas al clima frío o de frío moderado y pueden tolerar temperaturas que oscilan de SC a 15 2C, además de temperaturas de congelación, bastante bien si se han aclimatado previamente a temperaturas reducidas (Levitt, 198, Thomashow, 1999). Por el contrario, las especies tropicales y subtropicales, que incluyen cultivos importantes tales como maíz, arroz o tomate, son sensibles a bajas temperaturas y parecen carecer de mecanismos de aclimatación eficaces.

La tolerancia al frío y a la congelación se produce mediante diferentes mecanismos. La respuesta al frío implica la activación de unsaturasas que pueden cambiar la composición lipídica de las membranas generando una elevada fluidez de la membrana a bajas temperaturas. Por otra parte, la tolerancia a la congelación requiere un periodo de aclimatación previo. Durante este periodo de aclimatación, se sintetizan ciertas proteínas específicas y se acumulan.

Las proteínas anticongelantes se encuentran en una amplia variedad de plantas que sobreviven al invierno; inhiben el crecimiento y la recristalización de hielo producida en espacios intercelulares a las temperaturas de congelación. Estas proteínas presentan un alto nivel de homología con proteínas relacionadas con la patogénesis (PR) y, en algunos casos, también protegen contra patógenos psicrófilos (Griffith & Yaish, 24; Chinnusamy y col., 27). Otras especies presentan tolerancia a la congelación mediante un mecanismo que implica el aumento en sacarosa (Guy, 1992) o concentraciones de prolina libre (Nanjo y col., 1999).

Una de las estrategias para reducir la pérdida en la productividad de las plantas es aumentar la tolerancia al estrés natural, fortaleciendo los sistemas endógenos. Los factores de transcripción (FT) desempeñan una función crucial en la respuesta de las plantas a factores medioambientales, además de en el programa morfogenético. Son proteínas que actúan en trans, pueden reconocer y unirse a secuencias de ADN específicas (elementos que actúan en cis) localizadas en las regiones reguladoras de sus genes diana. Cuando estas proteínas se unen a sus dianas, activan o reprimen rutas de señales de la transducción.

Se han identificado aproximadamente 15 FT en plantas usando bioinformática, y los FT comprenden numerosas familias de genes. Sin embargo, aunque podrían participar en la respuesta, pueden no conferir necesariamente una tolerancia. Esto se ilustra, por ejemplo, por los FT de Arabidopsis ATHB7 y ATHB12 (Lee y Chun, 1998). Estos presentan una alta homología con HAHB4 de girasol, especialmente en el dominio HD-Zip. Ambos genes están regulados por incremento por la sequía y ABA. Sin embargo, también se mostró que las plantas transgénicas que expresan en exceso estos genes no son más tolerantes al estrés por sequía que las de TS. HAHB4 se describe en el documento WO 24/99365. Otro ejemplo es DREB2, un gen que se induce por temperaturas frías, pero no confiere tolerancia al frío en su forma no mutada. Por tanto, sigue siendo necesario empezar una serie de experimentos genómicos funcionales con el fin de probar y demostrar los efectos de los FT sobre la tolerancia al estrés, ya que tales efectos no pueden predecirse (Arce y col., 28).

Las proteínas HD-Zip caracterizadas por la presencia de un homeodominio asociado a una cremallera de leucina constituyen una familia de factores de transcripción de plantas. La asociación del dominio de unión a ADN (HD) con un motivo de dimerización adyacente (cremallera de leucina abreviada ZipLZ o LZ) es una combinación encontrada solo en el reino de las plantas, aunque los dominios se encuentran independientemente entre sí en un gran número de factores de transcripción eucariotas (Schena & Davis, 1992). Esta gran familia de FT de plantas se ha dividido en cuatro subfamilias (I a IV) según la similitud de secuencias dentro y fuera de los dominios conservados y por los patrones de intrones/exones de los genes correspondientes (Schena & Davis, 1994, Sessa y col., 1994, Chan y col., 1998; Ariel y col., 27). Los miembros de la subfamilia I interaccionan con la secuencia pseudopalindrómica CAAT(A/T)ATTG; las proteínas de la subfamilia II reconocen un motivo CAAT(C/G)ATTG (Sessa y col., 1993; Palena y col., 1999). En todos los casos, la formación de homo- o hetero-dímeros de proteína es un requisito previo para la unión del ADN (Sessa y col., 1993; González y col., 1997).

Varios autores han informado que la expresión de miembros de la familia HD-Zip de factores de transcripción está regulada por diversos factores externos tales como estreses por iluminación, ABA, sal o agua (Schena & Davis, 1992; Carabelli y col., 1993; Schena y col., 1993; Sóderman y col.,1994; Sóderman y col., 1996, han y col., 1998; Lee & Chun, 1998; Sóderman y col., 1999a y 1999b; Gago y col., 22; Henriksson y col.,25). Estudios en los que los genes HD-Zip I y II se expresaron en exceso en plantas transgénicas soportan adicionalmente la función propuesta de esta familia de proteínas como reguladores del desarrollo que son sensibles a condiciones medioambientales (Schena y col., 1993; Manavella y col., 26; Manavella y col., 28; Ariel y col., 27; Cabello y col., 27, Dezar y col., 25a). Sigue existiendo la necesidad de identificar y caracterizar tales proteínas de forma que puedan conferirse rasgos beneficiosos a las plantas que utilizan miembros específicos de esta clase de moléculas.

Se aisló ADNc de HAHB1 en 1992 de una biblioteca de tallo de girasol de ADNc y su secuencia se depositó en Genebank (número de acceso L22847, véase la SEC ID N2: 2: en el presente documento para la secuencia de ácidos nucleicos y SEC ID N2: 5 en el presente documento para la secuencia de proteínas traducida) y se describió la clonación del ADNc (Chan RL, González DH, 1994). La proteína codificada por este gen se ha citado en la bibliografía como un gen homólogo a proteínas HD-Zip de otras especies, pero esta conclusión se basa solo en la comparación de la secuencia en árboles filogenéticos (González y col. 1997, Chan y col., 1998 y Ariel y col., 27).

La presente invención demuestra sorprendentemente la utilidad de HAHB1 (homeocaja 1 de Helianthus annuus, de Helianthus Annuus Homeobox 1) en la producción de plantas transgénicas con tolerancia potenciada a condiciones de estrés.

Resumen de la invención

En la presente divulgación de patente, los presentes inventores describen el uso de HAHB1, un factor de transcripción que es un miembro de la subfamilia I del girasol de proteínas HD-Zip y variantes de las mismas, tales como ATHB13, para modificar las respuestas de las plantas a condiciones de estrés, que incluyen estrés por congelación, sequía, salinidad y biótico. Así, la divulgación... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento de aumento de la tolerancia tanto a la sequía como a la alta salinidad y la congelación que comprende transformar una planta con un ácido nucleico que comprende una secuencia de SEC ID N2 6 o 7 o una

secuencia con al menos el 9 % o al menos el 95 % de homología con una secuencia que comprende SEC ID N2 6 o 7.

2. Un procedimiento según la reivindicación 1, en el que la secuencia de ácidos nucleicos está bajo el control del promotor de HAHB1, que comprende un ácido nucleico de SEC ID N21.

3. Una construcción de ácidos nucleicos quimérica aislada que comprende una secuencia de ácidos nucleicos que codifica la secuencia de extremo N de otra proteína HD Zip de la subfamilia I asociada operativamente a una secuencia de ácidos nucleicos que codifica una secuencia que comprende el extremo C de HAHB1 como se define en SEC ID N2 8.

4. Un polipéptido codificado por medio de una construcción génica de la reivindicación 3.

5. Un polipéptido de la reivindicación 4, en el que el extremo N es el extremo N de HAHB4.

6. Un procedimiento para conferir tolerancia en una planta tanto a la sequía como a la alta salinidad y la congelación

que comprende introducir y expresar en una planta una construcción génica como se define en la reivindicación 3 o un polipéptido como se define en cualquiera de las reivindicaciones 4 o 5.

7. Uso de una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID N2 6 o 7, o una secuencia con al menos el 9 % o al menos 25 el 95 % de homología con SEC ID N2 6 o 7 o uso de un vector que comprende una secuencia de ácidos nucleicos de SEC ID N2 6 o 7 o una secuencia con al menos el 9 % o al menos el 95 % de homología con SEC ID N2 6 o 7, confiriendo elevada tolerancia tanto a la sequía como a la alta salinidad y la congelación.