Procedimientos y composiciones para la detección de analitos.

Sistema para detectar una pluralidad de analitos que comprende:

(a) un dispositivo de prueba de flujo lateral que comprende una tira absorbente y una cámara aguas arriba quecontiene un tampón de lavado liberable, comprendiendo la tira absorbente:

(i) una zona de aplicación de muestra,

(ii) una zona de detección que comprende una o más bandas oligonucleotídicas discretas unidas de manerano difusiva a dicha tira, y

(iii) una zona de control; y

(b) un dispositivo de recogida de muestras independiente de dicho dispositivo de prueba adecuado para laextracción de analito de una muestra, y configurado para interconectarse con una abertura del dispositivo deprueba de flujo lateral para el suministro de muestra líquida a la zona de aplicación de muestra,comprendiendo el dispositivo de recogida de muestras: un reactivo de extracción en un volumen de desde 50hasta 100 ml, unos reactivos para un inmunoensayo en una forma secada sólida para la extracción con lamuestra, comprendiendo los reactivos un primer conjugado y un segundo conjugado para cada uno de dichosanalitos:

(i) comprendiendo cada dicho primer conjugado una pareja de unión específica para su analito, y unoligonucleótido que presenta una secuencia complementaria a un oligonucleótido de una de dichasbandas discretas; y

(ii) comprendiendo cada dicho segundo conjugado una pareja de unión específica para su analito, y unmarcador.

Procedimientos y composiciones para la detección de analitos.

Antecedentes de la invención La presente invención se refiere ensayos para analitos (s) , por ejemplo, antígenos, en una muestra tal como una muestra biológica obtenida de un animal. En particular, la invención se refiere a unos procedimiento y dispositivo (s) para la detección de un/unos analito (s) utilizando restos de unión que seleccionan como diana específicamente un analito seleccionado. Más particularmente, los analitos que van a detectarse incluyen agentes infecciosos y/o componentes de los mismos.

Se han utilizado muchos tipos de ensayos para detectar la presencia de diversas sustancias, a menudo denominadas generalmente analitos o ligandos, en muestras corporales. Estos ensayos implican normalmente reacciones de antígeno-anticuerpo, ligando, antiligando, ligando-receptor y utilizan conjugados sintéticos que comprenden etiquetas solubles radiactivas, enzimáticas fluorescentes o metálicas observables visualmente, y especialmente cámaras de reactor diseñadas. Las pruebas más actuales están diseñadas para realizar una determinación cuantitativa, pero en muchas circunstancias todo lo que se requiere es una indicación cualitativa o positiva/negativa. Se han utilizado ensayos para detectar agentes infecciosos, tales como virus de la gripe.

Incluso los ensayos de positivo/negativo deben ser muy sensibles debido a la a menudo pequeña concentración del analito de interés en el fluido de prueba. Los falsos positivos también pueden ser problemáticos, particularmente con la aglutinación y otros procedimientos de detección rápida tales como una tira reactiva y pruebas de cambio de color. Debido a estos problemas, se han desarrollado ensayos de tipo sándwich y otros procedimientos de detección sensibles que utilizan dispersiones coloidales de metales u otros tipos de partículas coloreadas. Estas técnicas no han solucionado todos los problemas encontrados en estos procedimientos de detección rápida. Además, con el surgimiento de agentes altamente patógenos tales como virus de la gripe, resulta necesario desarrollar sistemas y procedimientos de laboratorio o punto de atención eficaces que puedan detectar de manera eficaz y precisa uno o más agentes infecciosos, tales como tipos de influencia o cepas dentro de los subtipos.

Se observa comúnmente la gripe en brotes locales o epidemias por todo el mundo. Pueden aparecer epidemias en cualquier momento y pueden producirse de manera fulminante con poco o ningún aviso. El número de personas afectadas puede variar desde unos cuantos cientos a cientos de miles. Las epidemias pueden ser de corta duración, durando días o semanas pero las epidemias más largas pueden persistir meses. Aunque la gripe es una enfermedad leve en la mayoría de los individuos, es potencialmente mortal para los individuos ancianos, los muy jóvenes o debilitados. Las epidemias son responsables de grandes pérdidas de productividad. Por tanto, resulta necesario desarrollar dispositivos y procedimientos para detectar eficazmente qué tipos y subtipos de un patógeno, tal como virus de la gripe, están presentes en muestras obtenidas de sujetos con el fin de determinar si la infección está provocada por un subtipo típico o esperado de virus de la gripe (gripe estacional) o un subtipo que es el agente causante de una epidemia o pandemia.

Es un objetivo de esta invención proporcionar un procedimiento rápido, sensible para detectar analitos en una muestra biológica. Otro objetivo es proporcionar un ensayo que presenta alta sensibilidad y menos falsos positivos que los ensayos convencionales. Un objetivo adicional es proporcionar un aparato o sistema para la detección de bajos niveles de analitos presentes en muestras biológicas. Otro objetivo es proporcionar un sistema de ensayo que implica un número mínimo de etapas de procedimiento, y produce resultados fiables incluso cuando se utiliza por personas no adiestradas. Un objetivo adicional es proporcionar un sistema para someter a prueba agentes infecciosos, que proporciona resultados que identifican uno o más agentes infecciosos en cuestión de minutos. Un objetivo adicional proporciona un sistema en el que los resultados en un instrumento de prueba son igualmente específicos y sensibles para los analitos diana, a pesar de que los resultados puedan leerse de una a varias horas tras la finalización de una reacción necesaria para obtener un resultado. Estos y otros objetivos y características de la invención resultarán evidentes a partir de la descripción, los dibujos y las reivindicaciones siguientes.

El documento EP0299428 da a conocer varias de las características del sistema de la presente solicitud. Sin embargo, el documento EP0299428 no da a conocer la utilización de restos de captura de polinucleótido para “clasificar” diversos inmunocomplejos en sus posiciones respectivas en las zonas de captura (tal como se reivindica en la presente memoria) . Además, el documento EP0299428 también enseña claramente que se proporcionan reactivos para el flujo lateral en la tira de flujo lateral tal como se describe en las reivindicaciones del documento EP0299428. La técnica anterior enseña claramente la disposición de los reactivos de unión en la tira de prueba. Por ejemplo, el documento US5602040 requiere claramente un ensayo de flujo lateral de “todo en uno” en el que los inmunorreactivos se disponen sobre la tira. Tales pruebas son adecuadas particularmente cuando la muestra es líquida (por ejemplo, orina, suero) o el analito está presente en cantidades relativamente grandes.

Sumario de la invención Formas de realización:

1. Un sistema para detectar una pluralidad de analitos que comprende:

(a) un dispositivo de prueba de flujo lateral que comprende una tira absorbente y una cámara aguas arriba que contiene un tampón de lavado liberable, comprendiendo tira absorbente:

(i) una zona de aplicación de muestra,

(ii) una zona de detección que comprende una o más bandas oligonucleotídicas diferenciadas unidas de manera no difusiva a dicha tira, y

(iii) una zona de control; y

(b) un dispositivo de recogida de muestras independiente de dicho dispositivo de prueba adecuado para la extracción de analito de una muestra, y configurado para interconectarse con una abertura del dispositivo de prueba de flujo lateral para el suministro de muestra líquida a la zona de aplicación de muestra, comprendiendo el dispositivo de recogida de muestras: reactivo de extracción en un volumen de desde 50 hasta 100 μl, reactivos para un inmunoensayo en forma secada sólida para la extracción con la muestra, comprendiendo los reactivos un primer conjugado y un segundo conjugado para cada uno de dichos analitos:

(i) comprendiendo cada dicho primer conjugado una pareja de unión específica para su analito, y un oligonucleótido que presenta una secuencia complementaria a un oligonucleótido de una de dichas bandas diferenciadas; y

(ii) comprendiendo cada dicho segundo conjugado una pareja de unión específica para su analito, y un marcador.

2. El sistema de la forma de realización 1, en el que los oligonucleótidos son pARN, presentando el pARN de cada banda diferenciada una secuencia diferente.

3. El sistema de la forma de realización 1, en el que el dispositivo de prueba comprende además un mecanismo para liberar el tampón de lavado puncionando, presionando o rompiendo un compartimento para el tampón de lavado.

4. El sistema de la forma de realización 3, en el que el compartimento comprende una ampolla o membrana blanda.

5. El sistema de la forma de realización 1, en el que el dispositivo de recogida de muestras comprende los primer y segundo conjugados en una primera cámara sellada, y comprende además un tampón de extracción de muestra en una segunda cámara, en el que el tampón de extracción puede liberarse de modo que se

permite la comunicación fluídica entre la primera cámara y la segunda cámara.

6. El sistema de la forma de realización 1, en el que los primer y segundo conjugados están en forma de un gránulo.

7. El sistema de la forma de realización 1, en el que las parejas de unión específica se seleccionan independientemente de anticuerpos monoclonales y policlonales.

8. El sistema de la forma de realización 1, en el que la zona de control comprende un elemento de unión

específica inmovilizado para un reactivo de control marcado, estando alojado el reactivo de control marcado 55 en dicho dispositivo de recogida de muestras.

9. El sistema de la forma de realización 1, en el que el dispositivo de prueba comprende una abertura u orificio para recibir el dispositivo de recogida... [Seguir leyendo]

1. Sistema para detectar una pluralidad de analitos que comprende:

(a) un dispositivo de prueba de flujo lateral que comprende una tira absorbente y una cámara aguas arriba que contiene un tampón de lavado liberable, comprendiendo la tira absorbente:

(i) una zona de aplicación de muestra,

(ii) una zona de detección que comprende una o más bandas oligonucleotídicas discretas unidas de manera no difusiva a dicha tira, y

(iii) una zona de control; y

(b) un dispositivo de recogida de muestras independiente de dicho dispositivo de prueba adecuado para la extracción de analito de una muestra, y configurado para interconectarse con una abertura del dispositivo de prueba de flujo lateral para el suministro de muestra líquida a la zona de aplicación de muestra, comprendiendo el dispositivo de recogida de muestras: un reactivo de extracción en un volumen de desde 50 hasta 100 μl, unos reactivos para un inmunoensayo en una forma secada sólida para la extracción con la muestra, comprendiendo los reactivos un primer conjugado y un segundo conjugado para cada uno de dichos analitos:

(i) comprendiendo cada dicho primer conjugado una pareja de unión específica para su analito, y un oligonucleótido que presenta una secuencia complementaria a un oligonucleótido de una de dichas bandas discretas; y

(ii) comprendiendo cada dicho segundo conjugado una pareja de unión específica para su analito, y un marcador.

2. Sistema según la reivindicación 1, en el que los oligonucleótidos son pARN, presentando el pARN de cada banda discreta una secuencia diferente.

3. Sistema según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de prueba comprende además un mecanismo para liberar el tampón de lavado puncionando, presionando o rompiendo un compartimento para el tampón de lavado.

4. Sistema según la reivindicación 3, en el que el compartimento comprende una ampolla o membrana blanda.

5. Sistema según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de recogida de muestras comprende los primer y segundo conjugados en una primera cámara sellada, y comprende además un tampón de extracción de muestra en una segunda cámara, en el que el tampón de extracción puede liberarse de modo que se permite la comunicación fluídica entre la primera cámara y la segunda cámara.

6. Sistema según la reivindicación 1, en el que los primer y segundo conjugados están en forma de un gránulo.

7. Sistema según la reivindicación 1, en el que las parejas de unión específica se seleccionan independientemente de anticuerpos monoclonales y policlonales.

8. Sistema según la reivindicación 1, en el que la zona de control comprende un elemento de unión específica inmovilizado para un reactivo de control marcado, estando alojado el reactivo de control marcado en dicho dispositivo de recogida de muestras.

9. Sistema según la reivindicación 1, en el que el dispositivo de prueba comprende una abertura u orificio para recibir el dispositivo de recogida de muestras para la aplicación de la muestra.

10. Sistema según la reivindicación 1, en el que el marcador es un marcador particulado seleccionado de entre oro coloidal, una partícula teñida o coloreada o un marcador particulado que comprende un metal lantánido.

11. Sistema según la reivindicación 10, en el que el marcador es una partícula de quelato de europio (III) fluorescente.

12. Sistema según la reivindicación 1, en el que el sistema comprende además un lector de fluorescencia.

13. Sistema según la reivindicación 12, en el que el lector de fluorescencia comprende una lámpara que emite UV A y/o un patrón duro.

14. Sistema según la reivindicación 1, en el que los analitos son de uno o más agentes infecciosos.

15. Sistema según la reivindicación 14, en el que se selecciona al menos un agente infeccioso de entre virus de la gripe, VIH, virus de la hepatitis, adenovirus, enterovirus y virus parainfluenza.

16. Sistema según la reivindicación 15, en el que dicho (s) agente (s) infeccioso (s) son virus de la gripe seleccionados independientemente de entre gripe A, B, C.

17. Sistema según la reivindicación 16, en el que el sistema detecta antígenos H1 y H3 de la gripe tipo A. 10 18. Sistema según la reivindicación 16, en el que el sistema detecta la gripe H1N1 o H5.