Procedimientos y composiciones para la biosíntesis recombinante de n-alcanos.

Un procedimiento para producir hidrocarburos, que comprende:

(i) cultivar un microbio fotosintético genomanipulado en un medio de cultivo,

donde dicho microbio fotosintético genomanipulado comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante; y

(ii) exponer dicho microbio fotosintético genomanipulado a la luz y al dióxido de carbono, donde dicha exposición da como resultado la conversión de dicho dióxido de carbono mediante dicho microbio fotosintético genomanipulado en n-alcanos, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos de 0,1% del peso de células secas y al menos dos veces la cantidad producida por un microbio fotosintético idéntico en todo lo demás, cultivada en condiciones idénticas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa.

Procedimientos y composiciones para la biosíntesis recombinante de n-alcanos

Referencias cruzadas con las solicitudes relacionadas Esta solicitud reivindica la prioridad de la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Nº 61/224.463 presentada el 9 de julio de 2009, la Solicitud de Patente Provisional de los Estados Unidos Nº 61/228.937, presentada el 27 de julio de 2009, y la solicitud de utilidad de los Estados Unidos 12/759.657, presentada el 13 de abril de 2010, presentadas con anterioridad.

Campo de la invención La presente divulgación se refiere a procedimientos para conferir propiedades productoras de alcanos a un microbio 15 fotosintético hospedador, de tal manera que el hospedador se puede usar en la producción comercial de bioalcanos.

Antecedente de la invención Muchos organismos fotoautótrofos existentes (es decir, plantas, algas, y bacterias fotosintéticas) son poco adecuados para el bioprocesamiento industrial y no han demostrado por tanto viabilidad comercial. Dichos organismos tienen normalmente tiempos de duplicación lentos (3-72 horas) , en comparación con los organismos heterótrofos industrializados tales como Escherichia coli (20 minutos) , que reflejan bajas productividades totales. Aunque el deseo de una producción biosintética de combustibles eficaz ha conducido al desarrollo de microorganismos fotosintéticos que producen ésteres de alquilo de ácidos grasos, sigue existiendo necesidad de procedimientos para producir hidrocarburos, por ejemplo, alcanos, utilizando organismos fotosintéticos.

Resumen de la invención La presente invención se refiere a procedimientos para producir productos de interés basados en carbono utilizando los genes AAR y ADN, las proteínas y las células hospedadoras descritas en el presente documento. En particular, la presente invención proporciona un procedimiento para producir hidrocarburos que comprende:

(i) cultivar un microbio fotosintético genomanipulado en un medio de cultivo, donde dicho microbio fotosintético genomanipulado comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal 35 monooxigenasa decarboxilativa recombinante;

(ii) exponer dicho microbio fotosintético genomanipulado a la luz y al dióxido de carbono, donde dicha exposición da como resultado la conversión de dicho dióxido de carbono mediante dicho microbio fotosintético genomanipulado en n-alcanos, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos de 0, 1% del peso de células secas y al menos dos veces la cantidad producida por un microbio fotosintético idéntico en todo lo demás, cultivada en condiciones idénticas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa. En una realización, la cantidad de dichos n-alcanos producida está entre 0, 1% y 5% del peso de células secas y al menos dos veces la cantidad producida por un microbio fotosintetico idéntico en todo lo demás, cultivada en condiciones idénticas, pero que carece de dichas enzimas AAR y ADM.

En una realización relacionada, la cantidad de n-alcanos producida por el microbio fotosintético genomanipulado es al menos de 0, 1%, 0, 2%, 0, 3%, 0, 4%, 0, 5%, 0, 6%, 0, 7%, 0, 8%, 0, 9%, o 1% del DCW, y al menos dos veces la cantidad producida por el microbio fotosintético idéntico en todo lo demás, cultivada en condiciones idénticas, pero que carece de dichas enzimas AAR y ADM recombinantes.

En una realización relacionada, al menos una de dichas enzimas recombinantes es heteróloga con respecto a dicho microbio fotosintético genomanipulado. En otra realización, dicho microbio fotosintético no sintetiza alcanos en ausencia de la expresión de una o ambas enzimas recombinantes. En otra realización, al menos una de dichas enzimas AAR o ADM recombinantes no es heteróloga para dicho microbio fotosintético genomanipulado.

En otra realización relacionada del procedimiento, dicho microbio fotosintético genomanipulado produce al menos un n-alqueno o n-alcanol. En otra realización más, el microbio fotosintético genomanipulado produce al menos un nalqueno o n-alcanol seleccionado entre el grupo que consiste en n-pentadeceno, n-heptadeceno, y 1-octadecanol. En una realización relacionada, dichos n-alcanos comprenden de forma predominante n-heptadecano, npentadecano o una de sus combinaciones en una realización relacionada, se producen más n-heptadecano y/o npentadecano que todos los otros productos de n-alcano combinados. En otra realización adicional relacionada, se producen más n-heptadecano y/o n-pentadecano por el microbio fotosintético genomanipulado que cualesquiera otros n-alcano o n-alqueno producidos por el microbio fotosintético genomanipulado. En otra realización adicional relacionada, se selecciona al menos un n-pentadeceno producido por dicho microbio fotosintético genomanipulado 65 entre el grupo que consiste en cis-3-heptadeceno y cis-4-pentadeceno. En otra realización más relacionada, se selecciona al menos un n-heptadeceno producido por dicho microbio fotosintético genomanipulado entre el grupo

que consiste en cis-4-pentadeceno, cis-6-heptadeceno, cis-8-heptadeceno, cis-9-heptadeceno, y cis, cis-heptadecdi-eno.

En otra realización adicional relacionada, la presente invención proporciona además una etapa de aislamiento de al

menos un n-alcano, n-alqueno o n-alcanol procedente de dicho microbio fotosintético genomanipulado o dicho medio de cultivo. En otra realización más relacionada, el microbio fotosintético genomanipulado se cultiva en un medio líquido. En otra realización más relacionada, el microbio fotosintético genomanipulado se cultiva en un fotobiorreactor.

En otra realización relacionada, las enzimas AAR y/o ADM están codificadas por un plásmido. En otra realización más relacionada, las enzimas AAR y/o ADM están codificadas por genes recombinantes incorporados al genoma de el microbio fotosintético genomanipulado. En otra realización adicional relacionada, las enzimas AAR y/o AQDM están codificadas por genes que están presentes en múltiples copias en dicho microbio fotosintético genomanipulado. En otra realización adicional relacionada, las enzimas AAR y/o ADM recombinantes están 15 codificadas por genes que son parte de un operón, donde la expresión de dichos genes está controlada por un único promotor. En otra realización más relacionada, las enzimas AAR y/o ADM recombinantes están codificadas por genes que se expresan de forma independiente bajo el control de promotores separados. En otra realización adicional relacionada, la expresión de las enzimas AAR y/o ADM recombinantes en un microbio fotosintético genomanipulado está controlada por un promotor seleccionado entre el grupo que consiste en un promotor cI, un promotor cpcB, un promotor lacl-trc, un promotor EM7, un promotor aphII, un promotor nirA, y un promotor nir07 (denominado en el presente documento “P (nir07) ”) . En otra realización más relacionada, las enzimas están codificadas por genes que son parte de un operón, donde la expresión de dichos genes está controlada por uno o más promotores inducibles. En otra realización adicional relacionada, al menos un promotor es represible por urea e inducible por nitrato. En una realización más relacionada, el promotor represible por urea e inducible por nitrato es un promotor de tipo nirA, En otra realización más relacionada, el promotor de tipo nirA es P (nir07) (SEC ID Nº : 24) .

En otra realización adicional relacionada, la especie de microbio fotosintético que se genomanipula para expresar las enzimas AAR y/o ADM recombinantes produce menos de aproximadamente 0, 01% del DCW de n-heptadecano o npentadecano en ausencia de las enzimas AAR y/o ADM recombinantes, un 0, 015 del DWC corresponde aproximadamente al límite de detección del n-heptadecano y n-pentadecano mediante los procedimientos de detección de la cromatografía de gases/ionización por llama descritos en el presente documento. En otra realización relacionada, el microbio fotosintético genomanipulado del procedimiento es un organismo termófilo. En otra realización más relacionada, el microbio fotosintético genomanipulado del procedimiento se selecciona entre el grupo que consiste en un Synechococcus sp. PCC7002 genomanipulado y un Thermosynechococcus elongatus BP

1 genomanipulado.

En otra realización más relacionada, las enzimas AAR y/o ADM se seleccionan entre el grupo de enzimas relacionadas en la Tabla 1 y la Tabla 2, respectivamente. En otra realización adicional relacionada, las enzimas AAR recombinantes se seleccionan entre el grupo que consiste en SYNPCC7942_1594, tII1312, PMT9312_0533, y cce_1430. En otra realización más relacionada, las enzimas ADM recombinantes se seleccionan... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para producir hidrocarburos, que comprende:

(i) cultivar un microbio fotosintético genomanipulado en un medio de cultivo, donde dicho microbio fotosintético genomanipulado comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante; y

(ii) exponer dicho microbio fotosintético genomanipulado a la luz y al dióxido de carbono, donde dicha exposición da como resultado la conversión de dicho dióxido de carbono mediante dicho microbio fotosintético genomanipulado en n-alcanos, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos de 0, 1% del peso de células secas y al menos dos veces la cantidad producida por un microbio fotosintético idéntico en todo lo demás, cultivada en condiciones idénticas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa recombinante y alcanal monooxigenasa decarboxilativa.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, donde al menos una de dichas enzimas recombinantes es heteróloga con respecto a dicho microbio fotosintético genomanipulado.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, donde dicho microbio fotosintético genomanipulado produce además al menos un n-alqueno o n-alcanol.

4. El procedimiento de la reivindicación 3, donde:

(a) dicho microbio fotosintético genomanipulado produce al menos un n-alqueno o n-alcanol seleccionado entre el grupo que consiste en n-pentadeceno, n-heptadeceno, y 1-octadecanol; (b) dichos n-alcanos comprenden de forma predominante n-heptadecano, n-pentadecano o una de sus combinaciones; o (c) comprende además aislar al menos un n-alcano, n-alqueno o n-alcanol a partir de dicho microbio fotosintético genomanipulado o dicho medio de cultivo.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, donde dichas enzimas están codificadas por:

(a) un plásmido.;

(b) genes recombinantes incorporados en el genoma de dicho microbio fotosintético genomanipulado;

(c) genes que están presentes en múltiples copias en dicho microbio fotosintético genomanipulado; o

(d) genes que son parte de un operón, y donde la expresión de dichos genes está controlada por un único promotor.

6. Un microbio fotosintético genomanipulado, donde dicho microbio fotosintético genomanipulado comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante; y donde dicho microbio fotosintético, cuando se cultiva en presencia de luz y dióxido de carbono, produce n-alcanos, y donde la cantidad de dichos n-alcanos producida es al menos un 0, 1% del peso de células secas y al menos dos veces la cantidad producida por un microbio fotosintético idéntico en todo lo demás, cultivado en condiciones idénticas, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa y alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes.

7. El microbio fotosintético genomanipulado de la reivindicación 6, donde dichas enzimas están codificadas por genes que están presentes en múltiples copias en dicho microbio fotosintético genomanipulado; preferentemente donde dichas enzimas están codificadas por un plásmido.

8. El microbio fotosintético genomanipulado de la reivindicación 6 o 7, donde dichas enzimas están codificadas por genes que son parte de un operón, y donde la expresión de dichos genes está controlada por un único promotor.

9. El microbio fotosintético genomanipulado de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 8, donde la expresión de las enzimas acil-ACP reductasa o alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes en dicho microbio fotosintético genomanipulado está controlado por un promotor seleccionado entre el grupo que consiste en un promotor cl, un promotor cpcB, un promotor lacl-trc, un promotor EM7, y un promotor aphII.

10. El microbio fotosintético genomanipulado de una cualquiera de las reivindicaciones 6 a 9, donde dicho microbio fotosintético genomanipulado es un termófilo.

11. Uso de un microbio fotosintético genomanipulado que comprende una enzima acil-ACP reductasa recombinante y una enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinante para producir n-alcanos cultivando dicho microbio fotosintético genomanipulado en presencia de luz y dióxido de carbono, donde la cantidad de dichos nalcanos producida es al menos un 0, 1% del peso de células secas y al menos dos veces la cantidad producida por un microbio fotosintético idéntico en todo lo demás, cultivado en idénticas condiciones, pero que carece de dichas enzimas acil-ACP reductasa y alcanal monooxigenasa decarboxilativa recombinantes.

12. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, donde la secuencia de aminoácidos de dicha

enzima acil-ACP reductasa es al menos un 95% idéntica a la SEC ID Nº : 6, SEC ID Nº : 10, o SEC ID Nº : 27, o donde la secuencia de aminoácidos de dicha enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa es al menos un 95% idéntica a la SEC ID Nº : 8; SEC ID Nº : 12 o SEC ID Nº : 29.

13. El microbio fotosintético genomanipulado de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde la secuencia de aminoácidos de dicha enzima acil-ACP reductasa es al menos un 95% idéntica a la SEC ID Nº : 6, SEC ID Nº : 10, o SEC ID Nº : 27, o donde la secuencia de aminoácidos de dicha enzima alcanal monooxigenasa decarboxilativa es al menos un 95% idéntica a la SEC ID Nº : 8, SEC ID Nº : 12 o SEC ID Nº : 29.

14. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5 , donde las secuencias de aminoácidos de dicha enzima acil-ACP reductasa y dicha alcanal monooxigenasa decarboxilativa son al menos un 95% idénticas a (i) la SEC ID Nº : 6 y la SEC ID Nº : 8, respectivamente; (ii) la SEC ID Nº : 10 y la SEC ID Nº : 12, respectivamente, o (iii) la SEC ID Nº : 27 y la SEC ID Nº : 29, respectivamente.

15.El microbio fotosintético genomanipulado de cualquiera de las reivindicaciones 6 a 10, donde las secuencias de aminoácidos de dicha enzima acil-ACP reductasa y dicha alcanal monooxigenasa decarboxilativa son al menos un 95% idéntica a (i) la SEC ID Nº : 6 y la SEC ID Nº . 8, respectivamente; (ii) la SEC ID Nº : 10 y la SEC ID Nº : 12; o (iii) la SEC ID Nº : 27 y la SEC ID Nº : 29, respectivamente.

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