Procedimientos para analizar el porcentaje de hemoglobina glicada.

Un procedimiento para analizar directamente el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje dehemoglobina glicada A1c en una muestra de sangre sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangre en unprocedimiento aparte,

comprendiendo dicho procedimiento:

a) poner en contacto fragmentos proteicos que contienen peptidos glicados o aminoacidos glicados con unafructosil aminoacido oxidasa para generar peroxido de hidrogeno (H2O2), donde los fragmentos proteicos segeneran poniendo en contacto la muestra de sangre con 1) un tampon de lisis que libera hemoglobina de losglobulos rojos en la muestra de sangre; 2) un primer agente oxidante que oxida de forma selectiva lassustancias reductoras de bajo peso molecular; 3) un segundo agente oxidante que oxida de forma selectiva lassustancias reductoras de alto peso molecular y 4) una proteasa que digiere la hemoglobina glicada en peptidosglicados o aminoacidos glicados, donde el primer agente oxidante se selecciona del grupo que consiste enperyodinano de Dess-Martin, N-etilmaleimida, yodoacetato sodico, peryodato sodico y cloramina-T, y el segundoagente oxidante se selecciona del grupo que consiste en una sal de tetrazolio, dodecilsulfato sodico, ferricianuropotasico (III) y yodato potasico, b) poner en contacto el H2O2 generado en la etapa a) con una sustanciaformadora de color en presencia de una peroxidasa para generar una senal cuantificable; y c) determinar elporcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en la muestra aplicando lasenal generada en la etapa b) a una curva de calibracion sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangrepor separado.

Procedimientos para analizar el porcentaje de hemoglobina glicada Declaración respecto a la investigación o desarrollo financiados federalmente No aplicable Campo de la invención La invención proporciona un ensayo enzimático directo para determinar el porcentaje de hemoglobina glicada en una muestra de sangre.

Antecedentes de la invención Una proteína glicada es una sustancia que se produce mediante la unión no enzimática e irreversible del grupo amino de un aminoácido constituyente de una proteína con el grupo aldehído de un azúcar reductor tal como aldosa. Véase, por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 6.127.138. Dicha reacción de unión no enzimática e irreversible también se denomina “reorganización de Amadori” y, por tanto, la proteína glicada mencionada anteriormente puede también denominarse “compuesto de Amadori” en algunos casos.

Se ha implicado a la glicación no enzimática de proteínas en el desarrollo de ciertas enfermedades, por ejemplo complicaciones diabéticas y el proceso de envejecimiento (Takahashi y col., J. BioI. Chem., 272 (19) : 12505 -7 (1997) ; y Baynes y Monnier, Prog. Clin. BioI. Res., 304: 1 -41 0 (1989) ) . Esta reacción conlleva la disfunción de moléculas diana a través de la formación de aductos de azúcar y reticulaciones. Se ha centrado un considerable interés en el producto de Amadori, que es la modificación “temprana” más importante durante la glicación no enzimática in vitro e in vivo.

Se conocen varios ensayos para proteínas glicadas. Por ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 6.127.138 divulga que una muestra que contiene una proteína glicada se trata con la proteasa XIV o una proteasa de Aspergillus genus, después (o mientras se está tratando la muestra con la proteasa anterior) se hace reaccionar la FAOD (fructosil aminoácido oxidasa) con la muestra con el fin de medir la cantidad de oxígeno consumido por la reacción de FAOD

o la cantidad del producto de reacción resultante para medir, de este modo, la proteína glicada.

En otro ejemplo, la patente de EE.UU. Nº 6.008.006 divulga que la cantidad de proteínas glicadas en una muestra se pueden cuantificar haciendo reaccionar la muestra con, en primer lugar, un reactivo que es una combinación de una proteasa y una peroxidasa y, en segundo lugar, con una cetoaminooxidasa. La patente de EE.UU. Nº 6.008.006 también divulga un kit que contiene el reactivo combinado enzimático peroxidasa/proteasa y, también, la cetoamino oxidasa. La publicación de EE.UU. Nº 2005/0014935 también divulga procedimientos y kits para medir la cantidad de proteína glicada usando una amadoriasa quimérica. La publicación de EE.UU. Nº 2003/0162242 y el documento EP 1304385 A1 también divulga procedimientos de determinar de forma selectiva la hemoglobina glicada. Sakurabayashi y col., ("New enzymatic assay for Glycohemoglobin", Clinical Chemistr y 49 (2) :269 -274 (2003) ) divulgan un procedimiento para determinar la hemoglobina glicada a través de la proporción de las concentraciones de hemoglobina glicada y hemoglobina total en la muestra.

Procedimientos descritos anteriormente para determinar el porcentaje de hemoglobina glicada A1c requieren una medición aparte de la hemoglobina total en las muestras. Cuando se usa un analizador químico para determinar el valor del porcentaje de hemoglobina glicada A1c se requiere un formato de canal doble. En este formato se realizan dos ensayos distintos para determinar 1) la concentración de hemoglobina glicada A1c y 2) la concentración de hemoglobina total en las muestras; y seguido del cálculo de la proporción entre la HbA1c glicada y la hemoglobina total para obtener el porcentaje de HbA1c.

Todas las patentes, solicitudes de patente y publicaciones citadas en el presente documento se incorporan por referencia en su totalidad.

Sumario de la invención La invención proporciona procedimientos para la determinación directa del porcentaje de hemoglobina glicada en una muestra de sangre sin la necesidad de una medición separada de la hemoglobina total en la muestra. Dado que no hay necesidad de una medición separada de la hemoglobina total y no hay necesidad de una etapa de cálculo de la proporción, los presentes procedimientos se pueden automatizar por completo y usar con varios analizadores químicos en un formato de un solo canal.

En un aspecto, la presente invención proporciona procedimientos para analizar directamente el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en una muestra de sangre sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangre en un procedimiento aparte, comprendiendo dicho procedimiento: a)

poner en contacto fragmentos proteicos que contienen péptidos glicados o aminoácidos glicados con una fructosil aminoácido oxidasa para generar peróxido de hidrógeno (H2O2) , donde los fragmentos proteicos se generan poniendo en contacto la muestra de sangre con 1) un tampón de lisis que libera hemoglobina de los glóbulos rojos en la muestra de sangre; 2) un primer agente oxidante que oxida de forma selectiva las sustancias reductoras de bajo peso molecular; 3) un segundo agente oxidante que oxida de forma selectiva las sustancias reductoras de alto peso molecular, donde el primer agente oxidante se selecciona del grupo que consiste en per y odinano de Dess-Martin, N-etilmaleimida, yodoacetato sódico, per y odato sódico y cloramina-T, y el segundo agente oxidante se selecciona del grupo que consiste en una sal de tetrazolio, dodecilsulfato sódico, ferricianuro potásico (III) y yodato potásico, y 4) una proteasa que digiere la hemoglobina glicada en péptidos glicados o aminoácidos glicados; b) poner en contacto el H2O2 generado en la etapa a) con una sustancia formadora de color en presencia de una peroxidasa para generar una señal cuantificable; y c) determinar el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en la muestra aplicando la señal generada en la etapa b) a una curva de calibración sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangre por separado.

En algunas realizaciones, el primer agente oxidante es per y odinano de Dess-Martin o N-etilmaleimida y donde el segundo agente oxidante es una sal de tetrazolio.

En algunas realizaciones, el tampón de lisis contiene el primer agente oxidante y/o el segundo agente oxidante. En algunas realizaciones, el tampón de lisis contiene el primer agente oxidante, el segundo agente oxidante y la proteasa. En algunas realizaciones, el tampón de lisis contiene la proteasa.

En algunas realizaciones, el primer agente oxidante y el segundo agente oxidante están formulados en una única composición. En algunas realizaciones, el primer agente oxidante y el segundo agente oxidante están formulados en una composición separada. En algunas realizaciones, la proteasa está formulada en una única composición con el primer agente oxidante o el segundo agente oxidante. En algunas realizaciones, el primer agente oxidante, el segundo agente oxidante y la proteasa están formulados en una única composición. En algunas realizaciones, la fructosil aminoácido oxidasa, la peroxidada y la sustancia formadora de color están formulados en una única composición.

En otro aspecto, la invención proporciona procedimientos para analizar directamente el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en una muestra de sangre sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangre en un procedimiento aparte, comprendiendo dicho procedimiento: a) poner en contacto fragmentos proteicos que contienen péptidos glicados o aminoácidos glicados con una fructosil aminoácido oxidasa de la SEC ID Nº 1 como se define en la reivindicación 16 para generar peróxido de hidrógeno (H2O2) , donde los fragmentos proteicos se generan poniendo en contacto la muestra de sangre con 1) un tampón de lisis que libera hemoglobina de los glóbulos rojos en la muestra de sangre; 2) un agente oxidante que es una sal de tetrazolio y 3) una proteasa que digiere la hemoglobina glicada en péptidos glicados o aminoácidos glicados; b) poner en contacto el H2O2 generado en la etapa a) con una sustancia formadora de color en presencia de una peroxidasa para generar una señal cuantificable; y c) determinar el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en la muestra aplicando la señal generada en la etapa b) a una curva de calibración sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangre por separado.

En algunas realizaciones, el tampón de lisis contiene el agente oxidante. En algunas realizaciones, el tampón de lisis contiene la proteasa. En algunas realizaciones, el agente oxidante y la proteasa están formulados en una única... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para analizar directamente el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en una muestra de sangre sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangre en un 5 procedimiento aparte, comprendiendo dicho procedimiento:

a) poner en contacto fragmentos proteicos que contienen péptidos glicados o aminoácidos glicados con una fructosil aminoácido oxidasa para generar peróxido de hidrógeno (H2O2) , donde los fragmentos proteicos se generan poniendo en contacto la muestra de sangre con 1) un tampón de lisis que libera hemoglobina de los 10 glóbulos rojos en la muestra de sangre; 2) un primer agente oxidante que oxida de forma selectiva las sustancias reductoras de bajo peso molecular; 3) un segundo agente oxidante que oxida de forma selectiva las sustancias reductoras de alto peso molecular y 4) una proteasa que digiere la hemoglobina glicada en péptidos glicados o aminoácidos glicados, donde el primer agente oxidante se selecciona del grupo que consiste en per y odinano de Dess-Martin, N-etilmaleimida, yodoacetato sódico, per y odato sódico y cloramina-T, y el segundo 15 agente oxidante se selecciona del grupo que consiste en una sal de tetrazolio, dodecilsulfato sódico, ferricianuro potásico (III) y yodato potásico, b) poner en contacto el H2O2 generado en la etapa a) con una sustancia formadora de color en presencia de una peroxidasa para generar una señal cuantificable; y c) determinar el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en la muestra aplicando la señal generada en la etapa b) a una curva de calibración sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangre por separado.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el primer agente oxidante es per y odinano de Dess-Martin y/o Netilmaleimida y donde el segundo agente oxidante es una sal de tetrazolio.

3. El procedimiento de la reivindicación 1 o 2, donde el tampón de lisis contiene al menos uno de los siguientes:

a) un primer agente oxidante b) un segundo agente oxidante c) una proteasa o

d) una combinación de cualquiera de a) , b) y c) .

4. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, donde el primer agente oxidante y el segundo agente oxidante están formulados en una única composición o una composición separada.

5. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, donde la proteasa está formulada en una única composición con a) el primer agente oxidante o b) el segundo agente oxidante o c) el primer agente oxidante y el segundo agente oxidante.

6. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la fructosil aminoácido oxidasa, la peroxidada y la sustancia 40 formadora de color están formulados en una única composición.

7. El procedimiento de la reivindicación 2, donde la sal de tetrazolio es sal monosódica de 2- (4-yodofenil) -3- (2, 4-dinitrofenil) -5- (2, 4-disulfofenil) -2H-tetrazolio o sal monosódica de 2- (4-yodofenil) -3- (4-nitrofenil) -5- (2, 4-disulfofenil) 2H-tetrazolio.

8. El procedimiento de la reivindicación 1, donde la sustancia formadora de color es la sal de sodio de NCarboximetilaminocarbonil) -4, 4'-bis (dimetilamino) -difenilamina (DA-64) , la sal hexasódica de N, N, N'N', N", N"-Hexa (3sulfopropil) -4, 4', 4", -triamino-trifenilmetano (TPM-PS) o la sal de sodio de 10- (carboximetilaminocarbonil) -3, 7bis (dimetilamino) -fenotiazina (DA-67) .

9. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, donde la fructosil aminoácido oxidasa comprende la secuencia de aminoácidos indicada en

10. El procedimiento de cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, que se usa en el pronóstico o diagnóstico de una enfermedad o trastorno.

11. El procedimiento de la reivindicación 10, donde la enfermedad o trastorno es diabetes.

12. Un kit para analizar directamente el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en una muestra de sangre sin la necesidad de una medición aparte del contenido de hemoglobina total en muestras de sangre, comprendiendo dicho kit:

a) un tampón de lisis que lisa las células sanguíneas para liberar hemoglobina; b) un primer agente oxidante que oxida de forma selectiva las sustancias reductoras de bajo peso molecular; donde el primer agente oxidante se selecciona del grupo que consiste en per y odinano de Dess-Martin, Netilmaleimida, yodoacetato sódico, per y odato sódico y cloramina T. c) un segundo agente oxidante que oxida de forma selectiva las sustancias reductoras de alto peso molecular; donde el segundo agente oxidante se selecciona del grupo que consiste en una sal de tetrazolio, dodecilsulfato sódico, ferricianuro potásico (III) y yodato potásico. d) una proteasa que hidroliza hemoglobina en un fragmentos proteicos que contienen péptidos glicados o aminoácidos glicados; e) una fructosil aminoácido oxidasa que reacciona con péptidos glicados y aminoácidos glicados para generar peróxido de hidrógeno (H2O2) ; f) una peroxidasa y una sustancia formadora de color; g) calibrador (Es) con un porcentaje conocido de hemoglobina glicada o un porcentaje conocido de hemoglobina A1c glicada para usar en la construcción de una curva de calibración; y h) instrucciones para realizar el procedimiento de la reivindicación 1.

13. El kit de la reivindicación 12, donde el primer agente oxidante y el segundo agente oxidante están contenidos en el tampón de lisis.

14. El kit de la reivindicación 12 o 13, donde el primer agente oxidante y el segundo agente oxidante están contenidos en el mismo tampón de lisis con la proteasa.

15. El kit de las reivindicaciones 12 a 14, donde la fructosil aminoácido oxidasa, la peroxidasa y la sustancia formadora de color están formulados en una única composición.

16. Un procedimiento para analizar directamente el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina glicada A1c en una muestra de sangre sin medir la hemoglobina total en la muestra de sangre en un procedimiento aparte, comprendiendo dicho procedimiento:

a) poner en contacto los fragmentos proteicos que contienen péptidos glicados o aminoácidos glicados con una fructosil aminoácido oxidasa para generar peróxido de hidrógeno (H2O2) , donde los fragmentos proteicos se generar poniendo en contacto la muestra de sangre con 1) un tampón de lisis que libera hemoglobina de los glóbulos rojos en la muestra de sangre; a) un agente oxidante que es una sal de tetrazolio y 3) una proteasa que digiere la hemoglobina glicada en péptidos glicados o aminoácidos glicados; y donde la fructosil aminoácido oxidasa comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 1 o es un fragmento o un derivado funcional de una fructosil aminoácido oxidasa que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 1, donde el fragmento o derivado funcional conserva al menos el 90 % de la actividad de la fructosil aminoácido oxidasa que comprende la secuencia de aminoácidos indicada en la SEC ID Nº 1; b) poner en contacto el H2O2 generado en la etapa a) con una sustancia formadora de color en presencia de una peroxidasa para generar una señal cuantificable; y c) determinar el porcentaje de hemoglobina glicada total o el porcentaje de hemoglobina A1c glicada en la muestra aplicando la señal generada en la etapa b) a una curva de calibración sin medir la hemoglobina total en la muestra por separado.

17. El procedimiento de la reivindicación 16, donde el tampón de lisis contiene el agente oxidante.

18. El procedimiento de la reivindicación 16 o 17, donde el tampón de lisis contiene la proteasa.

19. El procedimiento de cualquiera de las realizaciones 16 a 18, donde el agente oxidante y la proteasa están formulados en una única composición.