PROCEDIMIENTO Y SISTEMA PARA LA DETERMINACIÓN ABSOLUTA DEL PORCENTAJE DE AGREGACIÓN PLAQUETARIA.

Procedimiento para la obtención del porcentaje de agregación o inhibición plaquetaria, que comprende:

CAMPO DE LA INVENCIÓN [0001] Esta invención se refiere de un modo general a procedimientos y dispositivos para la determinación del porcentaje de inhibición plaquetaria y, más concretamente, a procedimientos y dispositivos para la determinación del porcentaje de inhibición plaquetaria en el tratamiento con fármacos que suprimen diferentes rutas de activación plaquetaria.

DESCRIPCIÓN DE LA TÉCNICA RELACIONADA [0002] El papel de las plaquetas en la fisiología de los mamíferos es extraordinariamente diverso, pero su función principal es la de promover la hemostasia. En muchas situaciones se desea evaluar la capacidad de coagulación de la sangre, un parámetro que se controla con frecuencia por medio de la capacidad que tienen las plaquetas para adherirse y/o agregarse. Por lo tanto, resulta de interés valorar las funciones adhesivas de las plaquetas. Las cuestiones de interés incluyen, por ejemplo, que si se han de administrar fármacos que bloquean o que fomentan la formación de coágulos, o si se han de detectar deficiencias en la función plaquetaria antes de las intervenciones quirúrgicas. Asimismo resulta interesante evaluar la eficacia de un inhibidor plaquetario que se esté ensayando como fármaco nuevo o se esté usando como tratamiento clínico autorizado en un paciente. [0003] Las plaquetas desempeñan un papel crítico en el mantenimiento de la hemostasia normal. Cuando un vaso sanguíneo está dañado, las plaquetas se adhieren a la matriz subendotelial expuesta. Tras la adhesión inicial, las plaquetas son activadas por diversos factores liberados o producidos en el lugar de la lesión, tales como trombina, ADP y colágeno. Una vez activadas las plaquetas, se produce un cambio conformacional en el receptor plaquetario glicoproteico GPIIb/IIIa, lo que le permite unirse a fibrinógeno y/o al factor von Willebrand. Es esta unión de moléculas multivalentes de fibrinógeno y/o del factor von Willebrand a los receptores GPIIb/IIIa de las plaquetas adyacentes lo que produce el reclutamiento de plaquetas adicionales al lugar de la lesión y su agregación para formar un tapón hemostático o trombo. [0004] “Agregación plaquetaria” es una expresión que se usa para describir la unión de unas plaquetas a otras. La agregometría plaquetaria in vitro es el procedimiento de laboratorio usado para valorar la capacidad in vivo de las plaquetas para formar los agregados que conducen a la formación de un tapón hemostático primario. En esta técnica, una muestra de sangre completa anticoagulada se centrifuga en múltiples condiciones para crear una muestra de plasma rico en plaquetas (PRP) y de plasma pobre en plaquetas (PPP). A continuación se añade al PRP un agente agregante, tal como ADP o colágeno, y se monitoriza ópticamente la agregación plaquetaria mientras que en paralelo se realiza una medición óptica separada usando la muestra de PPP. Después se determina el porcentaje de agregación usando el canal de PPP como valor de referencia del 100% de agregación y comparándolo con el canal de PRP. Puesto que la centrifugación de la sangre puede provocar la hemolisis de los glóbulos rojos, el cambio en la densidad óptica del PPP debido a la variabilidad de la preparación puede dar lugar a errores en el valor de referencia óptico usado para calcular el porcentaje de agregación. [0005] En otro procedimiento de agregometría plaquetaria in vitro usado en el laboratorio para valorar la capacidad de agregación plaquetaria in vivo se usa sangre completa diluida para medir el cambio en la impedancia eléctrica entre dos electrodos de metal precioso próximos cuando las plaquetas se adhieren y agregan tras la adición de un agente agregante, tal como ADP o colágeno. En este procedimiento no existe la posibilidad de realizar un ensayo único para determinar el porcentaje de agregación plaquetaria. Al contrario, se han de realizar dos ensayos separados y relacionar las dos mediciones para determinar el porcentaje de agregación. En el caso en que el paciente ya recibe un fármaco antiplaquetario, no hay forma de determinar su porcentaje de agregación plaquetaria. Los ensayos actuales para medir la agregación plaquetaria son costosos, largos, incómodos y, generalmente, inadecuados para un entorno clínico. [0006] Recientemente se ha desarrollado un ensayo rápido de la función plaquetaria, descrito en la patente de Estados Unidos nº 5.763.199. En el ensayo se determina el bloqueo del receptor glicoproteico (GP)IIb/IIIa en sangre completa diluida. Se obtiene una aglutinación de pequeñas perlas poliméricas recubiertas con un ligando de GPIIb/IIIa, tal como fibrinógeno, cuando las perlas se ponen en contacto con la sangre completa que contiene plaquetas con receptores GPIIb/IIIa activados que no están bloqueados. La ausencia de aglutinación indica un fallo en la activación de los receptores GPIIb/IIIa y/o un bloqueo de los receptores GPIIb/IIIa. En una realización preferida, la adición de un activador plaquetario, tal como ADP o ácido araquidónico, proporciona un ensayo que es lo suficientemente rápido y conveniente para ser realizado a la cabecera de la cama, y que produce la aglutinación de las pequeñas perlas poliméricas en un plazo conveniente conocido si no están bloqueados los receptores de activación. El ensayo incluye la posibilidad de trasladar la sangre que se ha de analizar desde un recipiente colector a un dispositivo de ensayo sin abrir el recipiente colector.

El documento US 6555064 describe un aparato y un procedimiento para determinar la eficacia de los reactivos antiplaquetarios o de los inhibidores de la función plaquetaria en la coagulación sanguínea y en la activación mecánica de las plaquetas. [0008] En el documento WO 2004/036226 se describen ensayos y procedimientos para medir la agregación plaquetaria en una muestra de sangre, medir la eficacia de los tratamientos antiplaquetarios en el lugar donde se ofrece el cuidado y determinar los microagregados plaquetarios en una muestra de sangre. La muestra de sangre obtenida de un individuo sometido a un tratamiento antiplaquetario se expone inmediatamente a un anticoagulante, y la muestra de sangre anticoagulada se trata con un agonista de la agregación plaquetaria. Con el fin de determinar el nivel de agregación plaquetaria se requiere un nivel basal que se puede obtener antes o durante el tratamiento plaquetario. El nivel de inhibición de la agregación plaquetaria se determina mediante un analizador hematológico. [0009] El documento WO 2005/007868 describe procedimientos para la realización de un ensayo de la actividad de la función plaquetaria en una muestra de sangre. Se describe el uso dual de activadores plaquetarios (tales como ADP) e inhibidores plaquetarios (tales como prostaglandina E1) para medir la función plaquetaria de inhibidores P2Y12. [0010] La agregación plaquetaria desempeña un papel clave en la patogénesis de la trombosis y de la arteriopatía coronaria aguda. Hay evidencias que sugieren que existe una variabilidad significativa en la función plaquetaria en respuesta a diferentes agentes antiplaquetarios. También se ha demostrado que existe una variabilidad entre individuos en la agregación plaquetaria cuando se usan antagonistas de P2Y12, tales como clopidogrel, en el tratamiento de pacientes para lograr un efecto antiagregante. Los resultados de un estudio han demostrado que al menos un 10% de los pacientes que recibieron el fármaco no alcanzaron la inhibición esperada de la agregación plaquetaria (Muller I, Besta F, Schulz C, Massberg S, Schonig A, Gawaz M; Prevalence of clopidogrel non-responders among patients with stable angina pectoris scheduled for elective coronary stent placement, Thromb Haemost. mayo de 2003, 89(5):783-7). [0011] Puesto que muchos pacientes con enfermedades cardiovasculares toman de forma crónica uno de los agentes de tipo tienopiridina, resultaría beneficioso disponer de un procedimiento para la determinación del nivel de inhibición plaquetaria basado en una única medición de una muestra inhibida. Además, los pacientes que se someten a procedimientos de ACTP generalmente reciben una alta dosis de bolo de un agente de tipo tienopiridina antes de la intervención. Algunos de estos pacientes pueden necesitar después una intervención quirúrgica de emergencia, y un ensayo que proporcionara información acerca de su nivel absoluto de inhibición plaquetaria sería beneficioso para valorar los riesgos de hemorragia antes de la cirugía. [0012] Existe demanda de un procedimiento mejorado para obtener el porcentaje de agregación o inhibición plaquetaria en presencia de fármacos antiplaquetarios. Asimismo existe demanda de un procedimiento para obtener el porcentaje de agregación o inhibición plaquetaria en presencia de fármacos antiplaquetarios, usando una única muestra...

1. Procedimiento para la obtención del porcentaje de agregación o inhibición plaquetaria, que comprende:

(a) proporcionar una muestra de sangre anticoagulada obtenida de un individuo tratado con un fármaco antiplaquetario;

(b) proporcionar un dispositivo de ensayo que presenta un primer canal (canal de ensayo) y un segundo canal (canal de control);

(c) introducir un primer activador plaquetario en el primer canal (canal de ensayo) del dispositivo de ensayo, siendo el activador plaquetario sensible a la ruta de activación objetivo del fármaco antiplaquetario;

(d) introducir un segundo activador plaquetario en el segundo canal (canal de control) del dispositivo de ensayo, siendo el segundo activador plaquetario insensible a la ruta de activación objetivo del fármaco antiplaquetario;

(e) introducir la muestra de sangre anticoagulada en el dispositivo de ensayo;

(f) medir simultáneamente el nivel de agregación plaquetaria en ambos canales; y

(g) determinar el porcentaje de agregación (AP) o inhibición (IP) plaquetaria de la siguiente manera:

% AP = (canal de ensayo/canal de control)*100% % IP = (1 -(canal de ensayo/canal de control))*100% = 100% -% AP

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el primer activador plaquetario se selecciona entre ácido araquidónico, ADP, colágeno, tromboxano A2 y epinefrina.

3. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que el segundo activador plaquetario se selecciona entre trombina y el péptido activador del receptor de trombina (iso-TRAP).

4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la muestra de sangre anticoagulada se selecciona entre sangre completa no diluida y sangre completa diluida.

**(Ver fórmula)**