Procedimiento simplificado para la evaluación de la calidad y posible contaminación de un suelo mediante ensayo con organismos, y kit para llevarlo a cabo.

Procedimiento simplificado para la evaluación de la calidad y posible contaminación de un suelo mediante ensayo con organismos,

y kit para llevarlo a cabo, que comprende

-Preparar cuatro placas de Petri (P) con semicírculos de papel de filtro (F).

- Añadir 0.4 ml de lixiviado de la muestra, en uno de los semicírculos de papel de filtro (F) test (T).

- Añadir 0.4 ml de agua desionizada en el lado opuesto, lado referencia (R), vigilando que el agua moje el otro.

- Colocar 10 organismos de ensayo (O) (colémbolos) sobre la separación (L) entre los semicírculos de filtro (F).

- Dejar reposar, sin luz y a temperatura ambiente (20-25°C) durante el período de exposición seleccionado (de 2 a 48 horas).

- Contar, después del tiempo de exposición, los organismos que hay en cada lado de la placa.

- Opcionalmente recontar a las 24 horas y a las 48 horas de exposición.

- Calcular el grado de alejamiento.

PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD Y POSIBLE CONTAMINACIÓN DE UN SUELO MEDIANTE ENSAYO CON ORGANISMOS, Y KIT PARA LLEVARLO A CABO

OBJETO DE LA INVENCIÓN

La invención, tal como expresa el enunciado de la presente memoria descriptiva, se refiere a un procedimiento simplificado para la evaluación de la calidad y posible contaminación de un suelo mediante ensayo con organismos, y kit para llevarlo a cabo, el cual aporta importantes ventajas y características de novedad, que se describirán en detalle más adelante, suponiendo una importante mejora del estado de la técnica respecto de los procedimientos de ensayo actualmente utilizados para el mismo fin.

Más en particular, el objeto de la invención se centra en un procedimiento para la evaluación de la toxicidad de una muestra de suelo potencialmente contaminado, utilizando el ensayo de alej amiento con colémbolos y que se basa en la tendencia al alejamiento de la muestra de suelo contaminado que experimentan los organismos de ensayo, con la particularidad de que dicha evaluación se consigue utilizando un sencillo kit de elementos de laboratorio y tan solo después de un tiempo de exposición de 48 horas y a 20°C de temperatura, siendo el parámetro indicador del estado de contaminación del suelo el porcentaje de población que se aleja del suelo muestra.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN

Los ensayos actuales normalizados proporcionan resultados sobre la calidad de los suelos, basándose en estudios de ecotoxicología. Normalmente se expresan como la concentración de suelo contaminado que causa un efecto predeterminado (mortalidad, inhibición de reproducción o alejamiento) al 50% de organismos de ensayo, y la duración del mismo está entre 2 y 28 días.

El objetivo de la presente invención es

desarrollar un nuevo procedimiento de ensayo para

evaluar una posible contaminación de un suelo,

utilizando organismos, pero de una forma mucho más

rápida y simplificada y con las mismas garantías de

resultado, debiendo señalarse que, por parte del solicitante se desconoce la existencia de ningfin otro procedimiento o invención de aplicación similar que presente unas características técnicas semejantes a las del procedimiento que aquí se preconiza segfin los principios de las reivindicaciones que acompañan a la presente memoria descriptiva del mismo.

EXPLICACIÓN DE LA INVENCIÓN

Esencialmente, con el procedimiento que la invención propone, la calidad ambiental de un suelo potencialmente contaminado, se evalfia a partir de la capacidad que tiene una muestra de suelo de causar el alejamiento de un porcentaje de individuos de la población de colémbolos que se expone al mismo, estando basado, concretamente, en el efecto del suelo contaminado sobre colémbolos de la especie Folsomia Candida. Estos invertebrados están presentes en la mayoría de suelos autóctonos.

Para la evaluación de la calidad ambiental de suelos, la invención propone una versión simplificada del ensayo de alejamiento que permite determinar el grado de alej amiento (porcentaj e de población alej ada) causado por el suelo contaminado, respecto a un control.

Mediante dicho procedimiento se determina directamente el Grado de Alej amiento que experimentan estos organismos causado por una muestra de suelo contaminado. El grado de alejamiento indica la calidad del suelo que se examina.

Los resultados se obtienen después de unas horas de exposición (entre 2 y 48 horas) de los organismos de ensayo al suelo contaminado, tiempo muy inferior al que necesitan otros ensayos normalizados. El procedimiento descrito y el uso del kit presentado permitirá, por lo tanto, realizar el ensayo de alej amiento de forma sencilla y rápida, sin necesidad de mantener un cultivo sincronizado de los organismos de ensayo, proporcionando resultados igualmente fiables Las principales novedades y ventajas del kit y del procedimiento propuesto respecto de los sistemas normalizados son:

Minimización de la manipulación experimental de la muestra de suelo. En el procedimiento propuesto se determina el Grado de Alejamiento (%) causado por el lixiviado del suelo contaminado. Este parámetro indica el efecto causado por los contaminantes presentes en el suelo muestra. Se evita la manipulación del suelo en la preparación de distintas concentraciones del mismo para obtener la CE50 (concentración de suelo que causa el 50% de alejamiento) , que es el parámetro que se determina en los ensayos normalizados de toxicidad de suelos.

Minimización de la variabilidad de resultados. El procedimiento experimental propuesto suprime el efecto de las diferencias edafológicas entre el suelo contaminado y el suelo de referencia. El ensayo se realiza utilizando el lixiviado del suelo contaminado, depositado en la superficie de un papel de filtro colocado en placas de Petri, donde se expone a los organismos de ensayo, utilizando como referencia agua.

Ventajas en relación a la manipulación experimental:

-El ensayo se realiza sobre el lixiviado de la muestra de suelo contaminado,

-No es necesario tamizar, homogeneizar ni manipular el suelo.

No es necesario tener un stock de suelo control.

No es necesario preparar diferentes concentraciones de suelo contaminado en suelo control.

Ventajas en relación a los organismos de ensayo: No es necesario tener una infraestructura para reproducir los organismos de ensayo.

No es necesario mantener un cultivo sincronizado de colémbolos adultos.

Cabe mencionar, además, que el procedimiento propuesto se puede llevar a cabo utilizando un sencillo kit de elementos de laboratorio, en el que se incluyen todos los materiales necesarios para la realización del ensayo de alejamiento con colémbolos y determinar el grado de alejamiento de los mismos de un suelo potencialmente contaminado, permitiendo dicho kit la realización de hasta tres ensayos, bien de tres suelos diferentes o determinación en triplicado sobre la misma muestra (que suele ser lo habitual para garantizar un resultado fiable) .

El descrito procedimiento simplificado para la evaluación de la calidad y posible contaminación de un suelo mediante ensayo con organismos, y el kit para llevarlo a cabo, representan, pues, una innovación de características estructurales y constitutivas desconocidas hasta ahora para tal fin, razones que unidas a su utilidad práctica, la dotan de fundamento suficiente para obtener el privilegio de exclusividad que se solicita.

DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS

Para complementar la descripción que se está realizando del procedimiento objeto de la invención y para ayudar a una mejor comprensión del mismo, se acompaña la presente memoria descriptiva, como parte

integrante de la misma, de un juego de planos, en los

que con carácter ilustrativo y no limitativo se ha

representado lo siguiente:

La figura número 1 Muestra una representación esquematizada de la distribución de las

placas de Petri utilizadas para el ensayo por

triplicado, según el procedimiento objeto de la

invención.

La figura número 2. Muestra una representación de una de las placas con los semicírculos de papel de filtro y la disposición de las muestras y organismos.

La figura número 3. Muestra una fotografía de una de las placas Petri utilizadas en el ensayo

REALIZACIÓN PREFERENTE DE LA INVENCIÓN

En la descripción detallada del procedimiento preconizado que se hace a continuación y en las figuras descritas, se han utilizado las siguientes definiciones y referencias alfanuméricas:

(T) Suelo Test: es la muestra de suelo supuestamente contaminado, sobre la cual se realiza el ensayo.

(R) Suelo Referencia: Suelo sin carga contaminante (C=O%)

(P) Placa de Petri.

(F) Semicírculos de papel de filtro.

(L) Línea de separación entre filtros

(O) Organismos de ensayo, consistentes en colémbolos de la especie Folsomia candida, individuos adultos de entre 12 y 20 días de edad.

De forma concreta, el procedimiento preconizado tiene como finalidad la determinación del Grado de Alejamiento (Porcentaje de organismos de ensayo que se han alejado del suelo contaminado) para cada muestra de suelo ensayado.

El porcentaje de alejamiento causado se determina utilizando cuatro placas de Petri (P) con 10 individuos u organismos (O) en cada una (total 40 individuos en cada réplica de ensayo) .

Normalmente se realizan tres replicados para obtener el resultado final de Grado de Alejamiento para una muestra concreta. (Expresado como el promedio de las tres determinaciones) .

1. PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD Y POSIBLE CONTAMINACIÓN DE UN SUELO MEDIANTE ENSAYO CON ORGANISMOS, aplicable para la evaluación de la toxicidad de una muestra de suelo potencialmente contaminado, basado en el ensayo de alejamiento con organismos (O) y que se fundamenta en la tendencia al alej amiento de la muestra de suelo contaminado que experimentan los organismos de ensayo, caracterizado, en primer lugar, porque se realiza sobre el lixiviado de la muestra de suelo contaminado, y comprende los siguientes pasos:

Preparar, placas de Petri (P) con dos semicirculas de papel de filtro (F) . Al menos, cuatro placas de test y, opcionalmente una de control.

-Añadir 0.4 ml del lixiviado de la muestra, en el lado T (test) de cada una de las cuatro placas

(P) , sobre el semicirculo de papel de filtro (F) correspondiente, de manera que siempre sea en el mismo lado de cada placa.

-Añadir 0.4 ml de agua desionizada en el lado R de cada una de las cuatro placas de Petri, es decir, sobre el otro semicirculo de papel de filtro que será el lado referencia (R) impidiendo que el agua moje el semicirculo de papel de filtro que contiene el lixiviado de la muestra de suelo test (T) del otro lado de la placa.

-Colocar 10 organismos de ensayo (O) sobre la linea de separación (L) entre los dos semicirculas de papel de filtro (F) . Cada tubo proporcionado en el kit contiene los 10 individuos necesarios para cada una de las placas.

-Dejar en reposo, en ausencia de luz y a temperatura ambiente (entre 20 25°C) durante el periodo de exposición elegido (entre 2 y 48 horas) .

-Contar después de 2 horas de exposición los organismos que hay en cada lado de la placa.

si procede, Realizar el recuento de colémbolos a las 24 horas y a las 48 horas de exposición.

Para verificar el correcto funcionamiento del ensayo, colocar también en las placas de control

0.4 ml de agua desionizada en ambos lados de la placa, a razón de una placa control por cada cuatro placas de ensayo.

Calcular el grado de alej amiento mediante la siguiente fórmula:

%Alejamiento 100 * (R-T) /N donde:

R: es el número total de individuos en el lado Referencia (suma de cuatro placas)

T: es el número total de individuos en el lado Test (suma de cuatro placas)

N: es el número total de individuos en el ensayo (N=

O)

2. PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD Y POSIBLE CONTAMINACIÓN DE UN SUELO MEDIANTE ENSAYO CON ORGANISMOS, según la reivindicación 1, caracterizado porque la obtención del lixiviado de la muestra de suelo contaminado comprende los siguientes pasos:

Colocar 100 g de suelo contaminado en un recipiente y mezclar con 1 L de agua desionizada. Cerrar el recipiente y mantener agitación durante 24 horas. Filtrar o centrifugar la mezcla para obtener el líquido sobrenadante.

-Utilizar este líquido sobrenadante para la

realización del ensayo.

3. PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD Y POSIBLE CONTAMINACIÓN DE UN SUELO MEDIANTE ENSAYO CON ORGANISMOS, según la reivindicación 1, caracterizado porque los organismos (O) utilizados son colémbolos de la especie Folsomia candida, individuos adultos de entre 12 y 20 días de edad.

4. PROCEDIMIENTO SIMPLIFICADO PARA LA EVALUACIÓN DE LA CALIDAD Y POSIBLE CONTAMINACIÓN DE UN SUELO MEDIANTE ENSAYO CON ORGANISMOS, según la reivindicación 1, caracterizado porque se realizan tres réplicas idénticas del ensayo con los mismos pasos de procedimiento en cada una.

5. KIT PARA LLEVAR A CABO UN PROCEDIMIENTO como el descrito en las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque comprende:

-Quince placas de Petri (P) de 5 mm de diámetro, que contienen cada una dos semicírculos separados de papel de filtro (F) , donde se deposita respectivamente el lixiviado del suelo contaminado, y la referencia.

-Dos pipetas de 5 ml de un solo uso. Quince tubos con diez organismos (O) colémbolos cada uno.

T

FIG.3