La presente invención se refiere a un procedimiento sencillo para la selección de variedades de semillas de trigo,

cebada, centeno, y en particular avena, que manipuladas genéticamente o no, permita que dichas semillas puedan ser usadas en la producción de alimentos y bebidas libres de gluten aptos para los pacientes celíacos, e incluso la elaboración de excipientes de determinados fármacos. Esta invención está basada en un sistema sencillo de detección inmunológica que permite cuantificar los péptidos más inmunogénicos del gluten con el objetivo de saber si la variedad de un cereal, preferentemente avena, puede ser usada para producir semillas aptas que puedan formar parte de la dieta de un celíaco. Los ensayos preferentes usarían al menos un anticuerpo que reconoce la parte más inmunogénica de las prolaminas, y cuya reactividad frente a las semillas del cereal haya demostrado ser proporcional a su inmunogenicidad con células T de enfermos celíacos.

Procedimiento para la selección de semillas de cereales aptas para ser

OBJETO DE LA INVENCiÓN

La presente invención tiene por objeto un sistema sencillo de detección inmunológica que permite cuantificar los péptidos más inmunogénicos del gluten con el objetivo de saber si la variedad de un cereal, preferentemente avena, puede ser usada para producir semillas aptas que puedan formar parte de la dieta de un celíaco. Se basa en ensayos inmunológicos con anticuerpos monoclonales que detectan el péptido 33-mer de la gliadina y otros péptidos afines tóxicos para los enfermos celíacos.

Se trata de un método específico y fiable que se puede aplicar industrialmente para identificar semillas de avena y otros cereales que sean tolerables y seguras para los pacientes celíacos. Los cereales seleccionados también pueden ser usados para hacer ingredientes que formen parte de excipientes de fármacos, y de otras aplicaciones industriales en productos que van a ser ingeridos por el colectivo celíaco. Por lo tanto, el procedimiento descrito en esta patente puede eventualmente tener un uso no sólo en el sector alimentario sino en el farmacéutico, siendo el sector agrícola el de interés preferente

ANTECEDENTES DE LA INVENCiÓN

La enfermedad celíaca (EC) se define como una altE~ración de la mucosa del intestino delgado proximal asociada con una intolerancia permanente al gluten, en individuos predispuestos genéticamente a los que se añaden factores ambientales. En esta enfermedad se desarrollan cambios morfológicos de la mucosa del intestino, con largas criptas y atrofias completas o parciales de las vellosidades intestinales después de la ingestión de productos elaborados con cereales, incluyendo aquellos derivados del trigo, la c.ebada, el centeno y probablemente la avena.

Las características clínicas de la EC difieren considerablemente en función de la edad de presentación. Los síntomas intestinales y el rl3traso del crecimiento son comunes en todos aquellos niños que hayan sido dia~lnosticados dentro de los primeros años de su vida (Stern y coL, 2001, Eur J Gastroenterol HepatoL, 13:741-747) . El desarrollo de la enfermedad en momentos posteriores de la infancia viene marcado por la aparición de síntomas extraintestinales, como anemia ferropénica refractaria, dispepsia, estreñimiento, dolores óseos y articulares, ataxia, elevación de las enzimas hepáticas, trastornos en la esfera reproductiva, etc. (Stern y coL, 2001, Eur J Gastroenterol HepatoL, 13:741-747) . La EC está asociada a trastornos autoinmunitarios como la enfermedad de Addison, tiroiditis autoinmune, hepatitis autoinmune, etc. Existen además otras patologías asociadas a la enfermedad celíaca como: síndrome de Down, síndrome de Turner, síndrome de Williams y déficit de inmunoglobulina A, enfermedades neurológicas, endocrinas, hepáticas, reumáticas, cardíacas, cutáneas, etc., incluidos tumores malignos de diferente localización, principalmente digestivos.

Originalmente considerado un síndrome raro de malaabsorción infantil, en la actualidad se considera una enfermedad común que afecta aproximadamente al 1% de la población, que puede ser diagnosticada a cualquier edad y que afecta a muchos sistemas orgánicos. Su base genética justifica que puede haber más de un paciente celíaco dentro de una misma familia.

Hasta la fecha, la única terapia efectiva existente es la exclusión completa y permanente del gluten de la dieta, lo que consigue la mejora o desaparición de los síntomas en prácticamente todos los pacientes. Aunque a primera vista llevar una dieta exenta de gluten pueda parecer sencillo, lo cierto es que determinadas situaciones favorecen su ingestión involuntaria, ya que cereales como el trigo están muy arraigados en nuestra sociedad, estando presentes en una gran cantidad de productos manufacturados. Se han llevado a cabo diversos estudios con el fin de determinar la cantidad máxima de gluten diaria que puede ser consumida por un enfermo celíaco de manera segura. Un estudio sugiere que la ingestión de trazas de gluten por los celíacos debe ser mantenida por debajo de 50 mg al día (Catassi y coL, 2007, Am J Clin Nutr., 85:160··166) . Sin embargo, y dado que existen distintos niveles de tolerancia a la ingestión de gluten entre los enfermos celíacos, la cantidad de gluten que puede ser ingerida por un enfermo celíaco no puede ser establecida de manera generalizada, existiendo enfermos celíacos que presentan alteraciones de la mucosa intestinal tras la ingesta de sólo 10 mg de gluten al día (Catassi y col., 2007, Am J Clin Nut~., 85:160-166) . Por lo tanto, el mantenimiento de una dieta exenta de gluten no es tarea sencilla, no sólo por el elevado coste económico que implica, sino también porque el gluten está presente en la mayoría de los alimentos que existen hoy día en el mercado. Así por ejemplo, el gluten es un ingrediente común en la dieta humana, quizás, después del azúcar es el ingrediente alimenticio más usado en la civilización Occidental. Por otro lado, hay que resaltar que, según la Comisión del Codex Alimentarius, en la actualidad un alimento "exento de glutBn" no es aquel cuyo contenido en gluten es O, sino el que contiene una cantidad je gluten inferior a 20 mg/kg. Por tanto, a pesar de que un paciente celíaco lleve a cabo una dieta estricta libre de gluten, estaría consumiendo de manera involuntaria pequeñas cantidades del mismo.

El gluten es una mezcla compleja de polipéptidos presente en cereales como el trigo, la cebada, el centeno y la avena. Los principales componentes inmunogénicos del gluten pertenecen a una familia de proteínas caracterizadas por su alto contenido en residuos de prolina y glutami'la, conocidas como prolaminas. Las prolaminas del trigo, la cebada, el centeno y la avena, se denominan gliadinas, hordeinas, secalinas y aveninas, respectivamente. La enfermedad se desencadena por la presencia de péptidos procedentes de la fragmentación de las prolaminas, las cuales no son digeridas por las proteasas gastrointestinales y resultan ser tóxicas para los pacientes celíacos. La estructura peptídica es esencial para producir el efecto tóxico, ya que cuando los polipéptidos de las prolaminas se hidrolizan hasta los aminoácidos constituyentes, se pierde la capacidad lesiva para el intestino. Entre los "péptidos tÓXiCOS" identificados el denominado 33-mer, (SEa ID N° 1, residuos 57-89 de la gliadina) que contiene 6 epítopos de reconocimiento de las células T es uno de los péptidos más inmunogénicos presente en la gliadina y uno de los responsable de la reacción inmune que se desencadena en el intestino de los pacientes c:::elíacos (Shan y col., 2002, Science, 297:2275-2279; Sollid, 2002, Nat Rev Immunol., 2:647-655) . Estos autores demostraron mediante estudios in vitro e in vivo en ratas y en humanos, que el péptido 33-mer de la a-gliadina es muy resistente a la proteólisis enzimática gástrica pancreática e intestinal. Estos péptidos pasan por la mucosa intestinal donde interaccionan con la transglutaminasa tisular, que transforma los residuos de glutamina en ácido glutámico y, como consecuencia de ello, se producen una serie de cambios que desencadenan reacciones con base inmunológica, que acaban destruyendo las vellosidades intestinales.

Como se ha indicado, actualmente el único tratamiento efectivo para la EC es mantener una dieta estricta exenta de productos elaborados con trigo, cebada, centeno y probablemente la avena. La presencia de este cereal en los alimentos "sin gluten" es controvertida. La avena se diferencia de otros cereales en su contenido en prolaminas, que representa entre un 10-20% del total proteico. Además, las prolaminas de los distintos cereales varían en tamaño molecular y en el contenido aminoacídico. En la avenina, la proporción de prolinas y glutaminas (aminoácidos abundantes en las regiones tóxicas) , es menor que en los otros cereales. Algunos investigadores aseguran que los pacientes celíacos toleran la avena sin signos de inflamación intestinal; de hecho en muchos países está permitido el uso de avena en alimentos "sin gluten", por ejemplo Gluten Free Oats®. La reactividad observada con un anticuerpo específico de gliadina en este cereal ha sido atribuida a la contaminación con trigo de alimentos elaborados a base de avena (Hernando y coL, 2008, Eur J Gastroenterol Hepatol., 20:545-554) . En contraste, existen investigaciones que confirman la tQ) (lcidad de la avena en determinados tipos de pacientes celíacos y la imposibilidaj de un consumo de avena de manera habitual. Arentz-Hansen y col. (2004, PloS Medic., 1 :84-92)... [Seguir leyendo]

1a ._ Método de selección de semillas de cereales caracterizado por el uso de métodos inmunológicos con anticuerpos que reconocen al péptid.

3. mer de la gliadina, de forma que cuando no presentan reactividad al gluten extraido de las semillas indican que son tolerables por individuos celíacos.

2a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos son ELlSA indirecto, ELlSA competitivo, ELlSA sandwich, tiras inmunocromatográficas, inmunomicropartículas fluorescentes, Western blots, biosensores, que usan al menos un anticuerpo que reconoce el péptid.

3. mer de la gliadina.

3a._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos usan al menos un anticuerpo monoclonal con capacidad para detectar los epítopos contenidos en e.

3. mer de la g!iadina SEO ID N° 1" SEO ID N° 2, SEO ID N° 3, SEO ID N° 4, SEO ID N° 5, SECl ID N° 6, SEO ID N° 7, SEO ID N° 8..

4a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos usan al menos un anticuerpo monoclonal de los siguientes G12, el A1 y el R5.

5a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos usan el anticuerpo monoclonal G12 conjugado a un enzima que permita un ensayo cuantitativo usando sustratos cromogénicos, fluorigénicos o luminiscentes.

6a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 mediante un ensayo inmunológico según las reivindicaciones del 2-5, caracterizado porque el ensayo podría usar un patrón de gliadina, gliadina hidrolizada, el péptid.

3. mer completo o una parte de su secuencia de al menos 6 aminoácidos (SEQ ID N° 2) .

7a ._ Método de selección de semillas según reivindicación 1 en el que los métodos inmunológicos están caracterizados por la relación de proporcionalidad entre la señal obtenida con el método objeto de la patente y el daño potencial causado por las proteínas tóxicas en los individuos celíaGos medido mediante proliferación celular y producción de INF-y por células T de pacientes con enfermedad celíaca.

sa._ Método de selección de semillas según reivindicación " usando los métodos inmunológicos según reivindicaciones 2-7 en el que las semillas son de trigo, cebada, centeno o avena.

ga._ Método de selección de variedades de semillas según reivindicación 1 usando los métodos inmunológicos según reivindicaciones 2-7 en el que las semillas son avena.

10a . Método de selección de cultivares de cereales según reivindicación 1 usando los métodos inmunológicos según reivindicaciones 2-7 en el que las semillas son de cereales manipulados genéticamente para disminuir su grado de inmunogenicidad para enfermos celíacos.

11 a. Uso de variedades de cereales seleccionadas según las reivindicaciones 1 a 7 como ingrediente en alimentos que vayan a ser etiquetados como libres de gluten.

12a. Uso de cultivares de avenas seleccionadas según las reivindicaciones 1 a 7, como ingrediente en alimentos que vayan a ser etiquetados como libres de gluten.