PROCEDIMIENTO PARA LA REDUCCION ENZIMATICA DE DERIVADOS DE ALQUINO.

Procedimiento para la obtención enzimática de derivados de alquenona de la fórmula general (2) a partir de derivados de alquinona a,

ß-insaturados de la fórmula general (1)

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/059071.

Solicitante: BASF SE.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: BASF SE08265920PF0000058294DP,67056 LUDWIGSHAFEN.

Inventor/es: HAUER, BERNHARD, STURMER, RAINER, DR., ROSCHE,BETTINA, MUELLER,ANDRE.

Fecha de Publicación: 15 de Abril de 2010.

Fecha Concesión Europea: 9 de Diciembre de 2009.

Clasificación Internacional de Patentes:

C12N9/02D
C12P7/26 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA. › C12P 7/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno. › Cetonas.

Clasificación PCT:

C07C5/09 C […] › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07C COMPUESTOS ACICLICOS O CARBOCICLICOS (compuestos macromoleculares C08; producción de compuestos orgánicos por electrolisiso electroforesis C25B 3/00, C25B 7/00). › C07C 5/00 Preparación de hidrocarburos a partir de hidrocarburos que contienen igual número de átomos de carbono. › en enlaces dobles carbono-carbono.
C12N9/02 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
C12P7/00 C12P […] › Preparación de compuestos orgánicos que contienen oxígeno.

PROCEDIMIENTO PARA LA REDUCCION ENZIMATICA DE DERIVADOS DE ALQUINO.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento para la reducción enzimática de derivados de alquino.

La invención se refiere a un procedimiento para la reducción enzimática de derivados de alquino.

Estado de la técnica

Hasta el presente no se conoce ningún procedimiento destinado a la reducción enzimática de derivados de alquino que no requiera trifosfato de adenosina ATP.

Los autores Takeshita, M. et al. describen en la publicación Journal of Molecular Catalysis B: Enzymatic 5 (1998) 245-248 ensayos destinados a la biotransformación asimétrica de derivados de fenilo con 4 átomos de carbono con la fracción del hígado de rata S-9 y con levadura de panificación. Según esta publicación no se transforma significativamente la 4-fenil-3-butin-2-ona de la fracción de hígado de rata en la correspondiente buten-2-ona en comparación con los controles. De igual modo, los ensayos con células de levadura completas proporcionaban una cantidad insignificante (rendimiento 3%) de buten-2-ona. Por el contrario, se formaron como componentes principales el correspondiente S-butan-2-ol (31%), la correspondiente butan-2-ona (8%) y el correspondiente S-butin-2-ol (5%). No pudo asociarse a estas biotransformaciones ninguna actividad enzimática determinada puesto que los ensayos fueron llevados a cabo con células completas de levadura. Por otra parte los ensayos se llevaron a cabo obligatoriamente en presencia de cofactores celulares, tal como por ejemplo el ATP.

Existía la tarea de proporcionar un procedimiento para la reducción enzimática de derivados de alquino, que no necesitase ATP.

Breve resumen de la invención

La tarea precedentemente indicada se resolvió mediante el empleo de las reductasas OYE 1, 2 y 3 y los equivalentes funcionales de las mismas para la reducción de los derivados de alquino de la fórmula general (1).

Descripción de las figuras

En las figuras adjuntas muestran

la figura 1 la biotransformación de 20 mM de 4-fenil-3-butin-2-ona con OYE 1-3 en presencia de fosfato del nucleótido de nicotinamida y de adenina reducido NADPH (izquierda) o del dinucleótido de nicotinamida NADH (derecha), el ácido etilendiaminotetraacético EDTA y el isopropanol a pH 6,8 y 30ºC al cabo de 1 hora. Los enzimas se sobreexpresaron en E. coli TG10⁺, el propio TG10⁺ sirvió como control;

la figura 2 las secuencias de aminoácidos de los enzimas empleados OYE 1, 2 y 3;

la figura 3 el mapa del plásmido de pAgro4;

la figura 4 el mapa del plásmido de pHSG575';

la figura 5 el mapa del plásmido de pDHE1658 OYE1;

la figura 6 el mapa del plásmido de pDHE1658 OYE2; y

la figura 7 el mapa del plásmido de pDHE1658 OYE3.

Descripción de la invención

La presente invención se refiere a un procedimiento para la obtención enzimática de derivados de alquenona de la fórmula general (2) a partir de derivados de alquinona a,ß-insaturados de la fórmula general (1)

en la que

R¹ significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, o un anillo aromático o no aromático, en caso dado substituido, carbocíclico o heterocíclico, y R² significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono o alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono,

por medio de la reducción de un compuesto de la fórmula (1) en presencia de una reductasa

(i) que comprende, al menos, una de las secuencias de polipéptido SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o (ii) con una secuencia de polipéptido funcionalmente equivalente, que presente, al menos, un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9.

De manera preferente, se proporciona de conformidad con la invención, de manera especial, la configuración E de los compuestos de la fórmula 2,

en la que

R¹ y R² tienen los significados que han sido indicados precedentemente. De manera especial, los compuestos de la fórmula 2 se presentan en más de un 50%, de manera especial en más de un 60, de un 70 o de un 80%, de manera preferente sin embargo en más de un 90%, tal como por ejemplo entre un 95 y un 99%, de manera especial aproximadamente en un 100% en la configuración E.

Básicamente puede llevarse a cabo el procedimiento de conformidad con la invención tanto con el enzima propiamente dicho purificado o enriquecido así como también con microorganismos, que expresen este enzima de manera natural o de manera recombinante, con homogenatos celulares derivados de los mismos o, cuando el microorganismo secrete el enzima en el medio circundante, con el sobrenadante del cultivo. De manera especial, una "reacción enzimática" abarca, en el sentido de la invención, también una reacción en un medio circundante exento esencialmente de ATP, es decir de manera preferente abarca una reacción con preparados enzimáticos exentos de células, tales como enzimas puros o enriquecidos o fracciones proteicas adecuadas, que ya no contengan componentes celulares de bajo peso molecular tal como especialmente el ATP.

Cuando no se indique otra cosa, significa:

vtcortaunaalquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono especialmente metilo, etilo, propilo, butilo, pentilo o hexilo, así como los correspondientes análogos monorramificados o polirramificados, tales como i-propilo, i-butilo, sec.-butilo, terc.-butilo, i-pentilo o neopentilo; siendo especialmente preferentes los restos alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono citados; vtcortaunaalquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono especialmente los análogos monoinsaturados de los restos alquilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, que han sido citados precedentemente, siendo especialmente preferentes los correspondientes restos alquenilo con 2 hasta 4 átomos de carbono. vtcortaunalos anillos carbocíclicos o heterocíclicos, aromáticos o no aromáticos, de manera especial anillos, en caso dado condensados, con 3 hasta 12 átomos de carbono y, en caso dado, con 1 hasta 4 heteroátomos, tales como N, S y O, de manera especial N u O. A título de ejemplos pueden citarse ciclopropilo, ciclobutilo, ciclopentilo, ciclohexilo, cicloheptilo, los análogos monoinsaturados o poliinsaturados de los mismos, tales como ciclobutenilo, ciclopentenilo, ciclohexenilo, cicloheptenilo, ciclohexadienilo, cicloheptadienilo; fenilo y naftilo; así como los restos heterocíclicos con 5 hasta 7 miembros, saturados o no saturados, con 1 hasta 4 heteroátomos, que se eligen entre O, N y S, pudiendo estar condensado el heterociclo, en caso dado, con otro heterociclo o con otro carbociclo. De manera especial deben citarse los restos heterocíclicos derivados de pirrolidina, de tetrahidrofurano, de piperidina, de morfolina, de pirrol, de furano, de tiofeno, de pirazol, de imidazol, de oxazol, de tiazol, de piridina, de pirano, de pirimidina, de piridazina, de pirazina, de cumarona, de indol y de quinolina. En caso dado los restos cíclicos, así como también los restos alquilo y los restos alquenilo que han sido citados precedentemente, pueden estar substituidos una o varias veces, tal como por ejemplo 1 vez, 2 veces o 3 veces. A título de ejemplo de los substituyentes adecuados deben citarse: halógeno, especialmente F, Cl, Br; -OH, -SH, -NO₂ -NH₃, -SO₃H, alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono y alquenilo con 2 hasta 4 átomos de carbono, alcoxi con 1 hasta 4 átomos de carbono; e hidroxi-alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono; estando definidos los restos alquilo y los restos alquenilo como precedentemente y los restos alcoxi se derivan de los restos alquilo correspondientes que han sido definidos preceden- temente.

El procedimiento, de conformidad con la invención, puede llevarse a cabo de manera especial con alquinos de la fórmula general (1), en los cuales R¹ significa alquilo con 1 hasta 4 átomos de carbono...

Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la obtención enzimática de derivados de alquenona de la fórmula general (2) a partir de derivados de alquinona a,ß-insaturados de la fórmula general (1)

en la que

R¹ significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono, alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, o un resto aromático o no aromático, carbocíclico o heterocíclico, en caso dado substituido, R²significa H, alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono o alquenilo con 2 hasta 6 átomos de carbono, quadmediante la reducción de un compuesto de la fórmula (1) en presencia de una reductasa (i) que comprende al menos una de las secuencias de polipéptido SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9 o (ii) con una secuencia de polipéptido funcionalmente equivalente, que presenta al menos un 80% de identidad secuencial con SEQ ID NO:1, 2, 3, 5, 7 o 9.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque la reducción se lleva a cabo con NADPH o con NADH a título de cofactor, independientemente del ATP.

3. Procedimiento según la reivindicación 2, caracterizado porque el cofactor empleado es regenerado por vía enzimática.

4. Procedimiento según la reivindicación 3, caracterizado porque la regeneración del cofactor se lleva a cabo por medio de glucosa-dehidrogenasa.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la reducción se lleva a cabo en un medio de reacción acuoso, acuoso-alcohólico o alcohólico.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque la reductasa está presente en forma inmovilizada.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que el enzima se elige entre las reductasas procedentes de Saccharomyces carlsbergensis (genoteca Q02899), Saccharomyces cerevisiae (genoteca Q03558) y Saccharomyces cerevisiae (genoteca P41816).

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se hace reaccionar un compuesto de la fórmula (1), en el que R¹ significa arilo, en caso dado substituido, y R² significa alquilo con 1 hasta 6 átomos de carbono.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que se obtiene el isómero E de los compuestos de la fórmula (2).

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones precedentes, en el que la reacción se lleva a cabo a una temperatura situada en el intervalo comprendido entre 0 y 45ºC y/o a un valor del pH situado en el intervalo comprendido entre 6 y 8.

11. Empleo de un compuesto de la fórmula (2), preparado según un procedimiento de conformidad con una de las reivindicaciones precedentes, como producto intermedio para la síntesis química o enzimática de principios activos.

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