Procedimiento para producir la toxina APXI de Actinobacillus pleuropneumoniae empleando un medio de cultivo que contiene borogluconato de calcio.

Método para producir toxina RTX Apxl cultivando bacterias Actinobacillus pleuropneumoniae en un medio de cultivo que soporta el crecimiento de las bacterias

, medio al que se añade una sal de calcio para formar iones de calcio en el medio, caracterizado por que el medio de cultivo contiene borogluconato para formar un complejo de borogluconato de calcio en el medio.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2009/065798.

Solicitante: INTERVET INTERNATIONAL B.V.

Nacionalidad solicitante: Países Bajos.

Dirección: WIM DE KÖRVERSTRAAT 31 5831 AN BOXMEER PAISES BAJOS.

Inventor/es: SLAGMAN,SIMEN-JAN, SMITS,CHRISTIAN THEODOOR GERARDUS, BULUT,BAYRAM.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de péptidos o de proteínas (proteína... > C12P21/02 (que tienen una secuencia conocida de varios aminoácidos, p. ej. glutation)

PDF original: ES-2458095_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento para producir la toxina APXI de Actinobacillus pleuropneumoniae empleando un medio de cultivo que contiene borogluconato de calcio La presente invención se refiere a un método para producir la toxina RTX Apxl cultivando bacterias Actinobacillus pleuropneumoniae en un medio de cultivo que soporta el crecimiento de las bacterias, a cuyo medio se añade una sal de calcio para formar iones calcio en el medio y que contiene borogluconato, para formar un complejo de borogluconato de calcio en el medio.

La pleuroneumonía porcina, una grave enfermedad respiratoria en cerdos, está mundialmente extendida y causa graves pérdidas económicas a la industria porcina debido a las muertes peragudas, al tratamiento de cerdos con enfermedad aguda y a los retrasos en la comercialización de animales crónicamente infectados. El agente etiológico es Actinobacillus pleuropneumoniae. Se transmite principalmente por contacto directo entre los animales y la infección resultante produce un curso clínico que varía de peragudo a crónico. La enfermedad es principalmente una infección del tracto respiratorio que cursa con los signos clínicos de fiebre alta, distrés respiratorio severo, tos y anorexia. La instauración de la enfermedad es rápida y la morbilidad y la mortalidad son altas. Una de las formas de control de las infecciones por Actinobacillus pleuropneumoniae (de ahora en adelante también denominado "APP") es mediante programas de vacunación. En el pasado, se han utilizado bacterinas en dichos programas, pero se las conocía por sus graves efectos colaterales. Actualmente, se usan comúnmente vacunas subunitarias basadas en las toxinas de APP.

APP produce las así llamadas toxinas RTX (RTX representa "repeat-in-toxin") . Es la presencia de estas toxinas RTX lo que contribuye en gran medida al carácter patogénico de esta bacteria. Las toxinas RTX han sido extensamente revisadas en el pasado y descritas en la literatura. Como es comúnmente sabido, no todos los serotipos de APP producen todas las toxinas RTX. Por ejemplo, los serotipos 1, 5, 9 y 11 producen Apxl y Apxll. Los serotipos 2, 3, 4, 6 y 8 producen ApxII y AxpIII. El serotipo 10 produce Apxl sólo y los serotipos 7 y 12 producen ApxII sólo. Las vacunas comercializadas actuales contra APP se basan en las toxinas Apxl, ApxII y ApxIII. Bastante recientemente, se ha visto que todos los serotipos de APP producen una cuarta toxina RTX, ahora denominada ApxIV (véase EP 0.875.574) .

Es comúnmente sabido cómo producir la toxina RTX Apxl cultivando Actinobacillus pleuropneumoniae en un medio de cultivo al que se añade una sal de calcio (es decir, un compuesto químico, basado en un ácido, formado reemplazando todos o parte de los iones hidrógeno del ácido con uno o más iones calcio) . En particular, EP

0.453.024 ya describe dicho método (véase el "Ejemplo 2", párrafo 2, "Purificación y caracterización de la hemolisina", subpárrafo "Métodos") . Obsérvese que se solía hacer referencia a ApxI como "HLY" (véase Frey et al., en "J. Gen. Microbiol., Agosto de 1993, 139 (8) : 1723-8") . Por esta patente EP, se conoce la adición de un compuesto de calcio (CaCl2) al medio. Ciertamente, en Microbiol. Pathogenesis 37 (2004) , 29-33, se dice que la actividad transcripcional del operón Apxl aumenta por la adición de calcio al medio de crecimiento. De esta forma, se pueden obtener altos niveles de Apxl. El medio debe soportar el crecimiento de bacterias APP. Es comúnmente sabido cómo constituir un medio que soporte el crecimiento de bacterias. Los medios de cultivo clásicos fueron originalmente desarrollados por Eagle, Ham y otros en los años 50 y 60. Vieron que un medio que cumpla con las necesidades básicas para el crecimiento debe incluir sales inorgánicas, una fuente de nitrógeno (por ejemplo, en forma de compuestos que contienen nitrógeno, tales como péptidos o proteínas) , una fuente de carbono y vitaminas. Los 45 medios son ventajosamente tamponados para evitar que se vuelvan demasiado ácidos o demasiado alcalinos. Dentro de esta receta básica, se dispone de muchas constituciones diferentes. Por ejemplo, se podría optar por componentes derivados de animales para aportar los aminoácidos, pero también se podrían escoger aminoácidos químicamente definidos. Para los otros compuestos, también son posibles numerosas variaciones. Ciertamente, constituir un medio que soporte el crecimiento de bacterias es relativamente simple. Sin embargo, la optimización del crecimiento y/o la producción de metabolitos puede llevar algún tiempo de desarrollo, en particular cuando se prefiere un medio que esté libre de suero u otros componentes derivados de animales. Se conocen, sin embargo, comúnmente en la técnica estrategias para mejorar el rendimiento del medio de fermentación, y se describen elaboradamente en la literatura (véase, por ejemplo, un artículo de revisión de Kennedy y Krouse en el Journal of Industrial Microbiology & Biotechnology (1999) , 23, 456-475) . Dicha optimización forma parte de los experimentos 55 rutinarios en un laboratorio de fermentación. En el caso del cultivo de APP, el NAD (dinucleótido de nicotinamida y adenina) forma parte inherentemente del medio, ya que el APP es dependiente de NAD. Sin NAD, el medio no soportará el crecimiento de las bacterias Actinobacillus pleuropneumoniae y no puede ser, por lo tanto, considerado como un medio líquido para soportar el crecimiento de APP en el sentido de la presente solicitud y de las reivindicaciones adjuntas. Se dispone comercialmente de medios para soportar el crecimiento de bacterias o de componentes para constituir dichos medios de diversas compañías, tales como Sigma Aldrich, Quest International, Oxoid, Becton Dickinson, Pharmacia, VGD Inc., Mediatech, Invitrogen, Marcor, Irvin Scientific, etc.

Aunque los métodos de la técnica anterior son suficientes para obtener un rendimiento económicamente relevante de la toxina Apxl, el solicitante reconoció que podría haber una posibilidad de mejora. Durante la fermentación, a 65 saber, el medio se vuelve opaco. Fue un mérito de los solicitantes darse cuenta de que esto podría deberse a una precipitación de una o más sales de calcio. APP específicamente produce dióxido de carbono, que en el medio da lugar a iones carbonato. El carbonato de calcio es una sal con una solubilidad particularmente baja. Como consecuencia, se pueden producir varios problemas. En primer lugar, se cree que la precipitación hace que los iones calcio implicados queden fuera del alcance de las bacterias APP. En segundo lugar, las sales de calcio precipitadas originan problemas en el procesamiento secuencia abajo. En particular, los filtros tienden a obstruirse. Por lo tanto,

el solicitante añadió diversos agentes acomplejantes al medio para ver si podían o no prevenir la precipitación de la sal. Ciertamente, por ejemplo añadiendo EDTA, el medio puede permanecer más o menos transparente. Sin embargo, el rendimiento de la producción de Apxl resulta negativamente influenciado por el uso de dichos agentes acomplejantes. La hipótesis, por lo tanto, podría ser errónea o incompleta. Existe aún un continuo deseo de mejorar la producción de Apxl.

Sorprendentemente, se ha visto que, cuando se usa borogluconato (v.g., en forma de 2, 3-dihidroxi-3-[2-hidroxi-5 (hidroximetil) -1, 3, 2-dioxaborolan-4-il]propanoato; véase también Herbert Taylor MacPherson y James Stewart, del Moredun Institute, en el Biochemical Journal, "Investigations on the nature of calcium borogluconate, vol. 32, nº 1, páginas 76-78, Enero de 1938) para acomplejar los iones calcio, se puede producir Apxl en gran nivel en 15 comparación con los métodos de la técnica anterior, que no usan agentes acomplejantes (añadidos) o que se basan en otros agentes acomplejantes. Aparentemente, utilizando este agente acomplejante... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Método para producir toxina RTX Apxl cultivando bacterias Actinobacillus pleuropneumoniae en un medio de cultivo que soporta el crecimiento de las bacterias, medio al que se añade una sal de calcio para formar iones de calcio en el medio, caracterizado por que el medio de cultivo contiene borogluconato para formar un complejo de borogluconato de calcio en el medio.

2. Método según la reivindicación 1, caracterizado por que la concentración de borogluconato es menor de 60

mmol/l. 10

3. Método según la reivindicación 2, caracterizado por que la concentración está entre 25 y 45 mmol/l.

4. Método según la reivindicación 3, caracterizado por que la concentración es de 40 mmol/l.

5. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que la sal de calcio es borogluconato de calcio.

6. Método según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado por que durante el cultivo se pasa aire a través del medio líquido, conteniendo dicho aire dióxido de carbono por encima del nivel atmosférico. 20

7. Método según la reivindicación 6, caracterizado por que el aire contiene un 5 % v/v de dióxido de carbono.