Procedimiento para la producción de L-metionina mediante fermentación de bacterias corineformes,

caracterizado porque se usan bacterias que producen L-metionina en las que se ha atenuado el gen arsR que tiene la secuencia que codifica el regulador de la transcripción ArsR.

Procedimiento para la producción de L-metionina usando bacterias corineformes La invención proporciona un procedimiento para la producción de L-metionina, usando bacterias corineformes en las que el gen arsR se ha atenuado, especialmente excluido. El gen mencionado codifica una proteína del grupo de los reguladores de la transcripción.

TÉCNICA ANTERIOR

Los compuestos químicos, por medio de lo cual se quiere decir especialmente L-aminoácidos, vitaminas, nucleósidos y nucleótidos y D-aminoácidos, se usan en medicina humana, en la industria farmacéutica, en cosméticos, en la industria alimentaria y en piensos para animales.

Muchos de estos compuestos se producen mediante fermentación de cepas de bacterias corineformes, especialmente Cor y nebacterium glutamicum. Debido a su gran importancia, se ha llevado a cabo constantemente un trabajo para mejorar los procedimientos de producción. Las mejoras a los procedimientos pueden estar relacionadas con medidas referidas a la fermentación, tales como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o la composición del medio nutriente, tal como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o el procesamiento hasta la forma de producto, por ejemplo, mediante cromatografía de intercambio iónico o las propiedades de comportamiento intrínsecas del propio microorganismo.

Para mejorar las propiedades de comportamiento de tales microorganismos, se usan métodos de mutagénesis, selección, y selección de mutantes. Estos métodos producen cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como, por ejemplo, el análogo de lisina S- (2-aminoetil) -cisteína, o los análogos de metionina !-metil-metionina, etionina, norleucina, N-acetilnorleucina, S-trifluorometilhomocisteína, ácido 2-amino-5-heptenoico, seleno-metionina, metioninsulfoxamina, metoxina, ácido 1-aminociclopentanocarboxílico, o que son auxotróficos para metabolitos que son importantes en términos de regulación, y que producen L-aminoácidos.

Durante varios años también se ha empleado la tecnología de ADN recombinante para mejorar la cepa de cepas productoras de L-aminoácidos de Cor y nebacterium glutamicum, amplificando genes de la biosíntesis de aminoácidos individuales y estudiando el efecto sobre la producción del L-aminoácido.

El documento WO02/097096 describe un procedimiento para producir preferiblemente L-metionina mediante fermentación de bacterias corineformes, en el que el gen regulador de la transcripción metD está atenuado, y el documento WO 02/18596 describe un procedimiento para producir preferiblemente L-lisina, en el que el gen regulador de la transcripción citB está atenuado.

OBJETO DE LA INVENCIÓN

Se ha marcado como objetivo proporcionar nuevas bases para procedimientos mejorados para la producción de Lmetionina mediante fermentación usando bacterias corineformes.

DESCRIPCIÓN DE LA INVENCIÓN

Cualquier mención de L-aminoácidos o aminoácidos aquí más abajo significa el aminoácido proteinogénico Lmetionina, incluyendo sus sales.

Por aminoácidos proteinogénicos se entiende los aminoácidos que aparecen en proteínas naturales, esto es, en proteínas de microorganismos, plantas, animales y seres humanos. Sirven como unidades estructurales para las proteínas, en las que están enlazados entre sí mediante enlaces peptídicos.

Cualquier mención de L-lisina o lisina aquí más abajo significa no sólo las bases, sino también las sales, tales como, por ejemplo, monohidrocloruro de lisina o sulfato de lisina.

Cualquier mención de L-metionina o metionina aquí más abajo significa también las sales, tales como, por ejemplo, hidrocloruro de metionina o sulfato de metionina.

La invención proporciona un procedimiento para la producción de L-metionina usando bacterias corineformes que, en particular, ya producen L-aminoácidos, y en las cuales el gen arsR, que tiene la secuencia de SEC ID NO: 500 del documento EP1108790 (=

que codifica el regulador de la transcripción ArsR, están atenuado, especialmente excluido, o está expresado a un nivel más bajo.

Esta invención proporciona además un procedimiento para la producción de L-metionina, en el que se llevan a cabo las siguientes etapas:

(a) fermentar bacterias corineformes productoras de L-metionina, en el que el gen arsR está atenuado, especialmente excluido, o está expresado a un nivel más bajo,

(b) concentrar el L-aminoácido en el medio o en las células de la bacteria, y

(c) aislar el L-aminoácido deseado, permaneciendo opcionalmente porciones (> 0 a 100%) o la totalidad de

los constituyentes del licor de fermentación y/o de la biomasa en el producto final. Las bacterias corineformes usadas preferiblemente ya producen el L-aminoácido L-metionina antes de atenuar el gen arsR.

Se ha encontrado que las bacterias corineformes producen L-metionina de manera mejorada después de la atenuación del gen arsR.

El producto génico del gen arsR que se va a atenuar pertenece al grupo de los reguladores de la transcripción. Los reguladores de la transcripción son aquellas proteínas que son capaces de unirse a ADN por medio de una estructura proteica específica, denominada el motivo de hélice-vuelta-hélice, y de este modo pueden potenciar o atenuar la transcripción de otros genes. La atenuación del regulador de la transcripción mencionado mejora la producción de L-metionina en las bacterias corineformes correspondientes.

Las secuencias nucleotídicas de los genes de Cor y nebacterium glutamicum mencionados forman parte de la técnica anterior, y se pueden encontrar en diversas solicitudes de patentes y también del banco de datos del National Center for Biotechnology Information (NCBI) de la National Librar y of Medicine (Bethesda, MD, USA) .

gen smtB: Nombre: Represor de la transcripción SmtB Función: Represor, dependiente de metales, de la expresión del gen smtA que codifica una metalotioneína, regulación de la respuesta celular a diversos metales pesados, familia de ArsR Referencias: Secuencias nº 3056 y nº 7068 del documento EP1108790; secuencia nº 559 del documento WO 01/00805 Nº de acceso: AX123140, AX127152 y AX066977 gen cgl1: Nombre: Regulador de la transcripción Cgl1 Función: Regulador de la transcripción de la familia GntR Referencias: Secuencias nº 3251 y nº 7069 del documento EP1108790 Nº de acceso: AX123335 y AX127153 gen hspR: Nombre: Proteína reguladora del choque térmico HspR Función: Se une en la región promotora en dirección 5' del gen dnaK que codifica una chaperona Referencias: Secuencias nº 3073 y nº 7068 del documento EP1108790 Nº de acceso: AX123157 y AX127152 gen cgl2: Nombre: Regulador de la transcripción Cgl2 Función: Regulador de la transcripción de la familia TetR Referencias: Secuencias nº 1700 y nº 7064 del documento EP1108790

Nº de acceso: AX121784 y AX127148

gen cebR:

Nombre: Regulador de la transcripción CebR

Función: Regulación de la captación de celobiosa y celotriosa Referencias: secuencias nº 2889 y nº 7068 del documento EP1108790

Nº de acceso: AX122973 y AX127152

gen cgl3:

Nombre: Regulador de la transcripción Cgl3

Función: Regulador de la transcripción de la familia TetR

Referencias: secuencias nº 3379 y nº 7069 del documento EP1108790

Nº de acceso: AX123463 y AX127153

gen gatR:

Nombre: Regulador de la transcripción GatR

Función: Represor del operón Gat para la captación y utilización de galacticol Referencias: secuencias nº 129 y nº 1 del documento EP1108790 secuencia nº 195 del documento WO 01/00844

Nº de acceso: AX12 0213, AX120085 y AX065069

gen glcR:

Nombre: Regulador de la transcripción GlcR

Función: Regulador de la transcripción de la familia DeoR

Referencias: secuencias nº 123 y nº 1 del documento EP1108790

Nº de acceso: AX120207 y AX120085

gen tcmR:

Nombre: Represor de la transcripción TcmR

Función: Regulación de resistencia a tetracenomicina y exportación, familia TetR

Referencias: secuencias nº 424 y nº 7060 del documento EP1108790; las bases 506... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la producción de L-metionina mediante fermentación de bacterias corineformes, caracterizado porque se usan bacterias que producen L-metionina en las que se ha atenuado el gen arsR que tiene la secuencia que codifica el regulador de la transcripción ArsR.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicho gen se ha excluido o expresado a un nivel bajo.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque se llevan a cabo las siguientes etapas: a) fermentar dichas bacterias corineformes; b) concentrar el producto en el medio o en las células de las bacterias, y c) aislar la L-metionina deseada, porciones (> 0 a 100 %) o la totalidad de constituyentes del licor de

fermentación y/o de la biomasa que queda opcionalmente en el producto final.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 a 3, caracterizado porque se usan bacterias en las que están potenciados adicionalmente otros genes de la ruta biosintética de la L-metionina deseada.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 a 4, caracterizado porque se usan bacterias en las que las rutas metabólicas que reducen la formación de la L-metionina deseada están al menos parcialmente excluidas.

6. Procedimiento según la reivindicación 1 a 5, caracterizado porque las propiedades reguladoras y/o catalíticas del polipéptido (proteína enzimática) codificado por la secuencia del gen arsR según la reivindicación 1 están reducidas.

7. Procedimiento según la reivindicación 1 a 6, caracterizado porque, para la producción de L-metionina, hay microorganismos corineformes fermentados en los que uno o más genes seleccionados del grupo

7.1 el gen lysC que codifica una aspartato cinasa resistente a la retroalimentación, 7.2 el gen gap que codifica gliceraldehído-3-fosfato deshidrogenasa.

7.3 el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa, 7.4 el gen zwf que codifica glucosa-6-fosfato deshidrogenasa, 7.5 el gen mqo que codifica malato:quinona oxidorreductasa, 7.6 el gen zwa1 que codifica la proteína Zwa1, 7.7 el gen tpi que codifica triosa-fosfato isomerasa, y

7.8 el gente pgk que codifica 3-fosfoglicerato cinasa está/están potenciado (s) al mismo tiempo.

8. Procedimiento según la reivindicación 7, caracterizado porque dicho (s) gen (es) está/están sobreexpresado (s) .

9. Procedimiento según la reivindicación 1 a 6, caracterizado porque, para la producción de L-metionina, hay microorganismos corineformes fermentados en los que uno o más genes seleccionados del grupo

9.1 el gen ccpA1 que codifica una proteína de control de catabolito A, 9.2 el gen pck que codifica fosfoenol piruvato carboxicinasa, 9.3 el gen pgi que codifica glucosa-6-fosfato isomerasa, 9.4 el gen poxB que codifica piruvato oxidasa, 9.5 el gen fda que codifica fructosa bifosfato aldolasa,

9.6 el gen zwa2 que codifica la proteína Zwa2,

9.7 el gen thrB que codifica homoserina cinasa, 9.8 el gen ilvA que codifica treonina deshidratasa, y 9.9 el gen thrC que codifica treonina sintasa, 5 está/están atenuado (s) al mismo tiempo.

10. Procedimiento según la reivindicación 9, caracterizado porque dicho gen (es) está/están excluido (s) , o su expresión está/están reducida (s) .

11. Procedimiento según una o más de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque se usan microorganismos de la especie Cor y nebacterium glutamicum.

12. Bacterias corineformes en las que el gen arsR que tiene la secuencia según la reivindicación 1 está presente en forma atenuada.

13. Bacterias corineformes según la reivindicación 12, en las que dicho gen está excluido o expresado a un nivel bajo.

26 Figura 1: Mapa de pCR2.1malIint plasmídico 27 Figura 2: Mapa de pCR2.1gatRint plasmídico 28 Figura 3: Mapa de pCR2.1glpR2int plasmídico