PROCEDIMIENTO PARA LA PREPARACION DE LINEAS CELULARES HUMANAS PERMANENTES.

Procedimiento para la preparación de una línea celular humana permanente,

en el que se transfectan simultáneamente amniocitos aislados con

(i) una molécula de ácido nucleico o

(ii) al menos dos moléculas distintas de ácido nucleico,

y en caso de transfectar una molécula de ácido nucleico, la molécula de ácido nucleico presenta una secuencia que permite la expresión de E1A y E1B de adenovirus humano y la expresión de un polipéptido recombinante, y en caso de transfectar al menos dos moléculas distintas de ácido nucleico, la primera molécula de ácido nucleico presenta una secuencia que permite la expresión de E1A y E1B de adenovirus humanos y la segunda molécula de ácido nucleico presenta una secuencia que permite la expresión de al menos un polipéptido recombinante

Procedimiento para la preparación de líneas celulares humanas permanentes.

La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una línea celular humana permanente, en el que se transfectan células humanas primarias aisladas simultáneamente con una secuencia que permite la expresión de al menos un factor transformante celular y una secuencia que permite la expresión de al menos un polipéptido recombinante.

La producción de polipéptidos recombinantes con fines terapéuticos, de diagnóstico o técnicos en cultivo celular (in vitro) se realiza generalmente en líneas celulares estables establecidas duraderas o permanentes en las que se integra el ácido nucleico que codifica el polipéptido en el ADN cromosómico de la célula (denominada línea celular productora). Estas líneas celulares productoras deben presentar particularmente dos propiedades características: en primer lugar, deben crecer de forma duradera (permanente) en el cultivo celular y ser multiplicables, y en segundo lugar, deben expresar el gen que codifica el polipéptido deseado, que puede aislarse entonces de la célula o del sobrenadante de cultivo. Además de bacterias, levaduras y células de plantas, se usan particularmente células animales para la producción de polipéptidos recombinantes. Aproximadamente un 60-70% de todas las proteínas terapéuticas se producen hoy en día en células de mamífero (Wurm, Nat. Biotechnology 22, 1393-1398, 2004). La preparación de células productoras proviene generalmente de líneas celulares ya inmortalizadas o transformadas que crecen y se multiplican de forma duradera en cultivo celular como, por ejemplo, células CHO (ovario de hámster chino), BHK (riñón de cría de hámster), NS0 (mieloma de ratón) o células humanas HEK293 (riñón embrionario humano) o PER.C6. Estas líneas celulares, que son también obtenibles comercialmente, se generaron casi como primera etapa del procedimiento para el establecimiento de células productoras mediante manipulación genética de células primarias en cultivo o se aislaron a partir de un tumor natural.

En la obtención de las células productoras reales, se transfiere mediante transfección a estas líneas celulares ya establecidas por un lado el ácido nucleico que codifica el polipéptido recombinante (el denominado transgén), con los elementos reguladores de la transcripción necesarios, y por otro lado un segundo módulo de expresión con un gen que codifica un marcador de selección y cuyo producto génico procura una determinada ventaja selectiva a la célula. Pocos días después de la transferencia génica, mientras se cultivan las células en un medio de cultivo sin reactivo de selección, se añade al medio un reactivo de selección adecuado. En presencia del reactivo de selección, sobreviven y crecen sólo las células que han incorporado los ácidos nucleicos empleados para la transfección y que expresan el marcador de selección: son marcadores de selección empleados frecuentemente el gen de resistencia a neomicina, el gen de resistencia a higromicina y la dihidrofolato reductasa (DHFR) (Wurm, Nat. Biotechnology 22:1393-1398, 2004; Wurm y Jordan, 309-333 en: Makrides (Ed.), "Gene Transfer and Expression in Mammalian Cells", Elsevier, Amsterdam, 2003). La selección se realiza correspondientemente en medio de cultivo con reactivos de selección como los antibióticos neomicina o higromicina o el glucocorticoide sintético metotrexato. Las células con el marcador de selección y el transgén que sobreviven al proceso de selección y proliferan (denominadas transformantes) se aíslan generalmente a continuación (se clonan) para asegurar que todas las células del cultivo son genéticamente idénticas y para separar las líneas celulares productoras deseadas con la mejor tasa de producción de las líneas celulares productoras menos buenas.

Los reactivos de selección deben añadirse al medio, según el proceso de preparación y según las circunstancias, no sólo durante la fase de selección, sino también después en el cultivo de las células clonadas para asegurar la estabilidad genética de las células productoras. El gen del polipéptido deseado (transgén) y el gen del marcador de selección se integran generalmente en el mismo sitio del genoma celular. A falta de presión selectiva durante la posterior expansión de las células o durante la fase de producción, existe el riesgo de que las células pierdan el marcador de selección, y por tanto también el transgén del polipéptido deseado. Esto se impide mediante la adición continua de reactivo de selección.

Las células primarias animales y humanas que se aportan al cultivo celular después de extracción del organismo o tejido, crecen generalmente sólo durante poco tiempo y pocos pases. Las células humanas son especialmente bien adecuadas para la preparación de productos bioterapéuticos humanos, ya que expresan péptidos complejos, en contraposición con otras células de mamífero o células animales, con un patrón de modificación postraduccional auténtico. El patrón de glucosilación de proteínas recombinantes complejas, o sea la estructura y disposición de los restos de azúcar en la molécula, reproduce esencialmente mejor en una preparación en células humanas el patrón del polipéptido humano auténtico que en una preparación en sistemas de producción no humanos. Este patrón de glucosilación es a menudo de importancia decisiva para propiedades importantes del polipéptido como actividad biológica, estabilidad, solubilidad e inmunogenicidad.

Se han aislado líneas celulares humanas establecidas de forma duradera (líneas celulares humanas permanentes), que podrían usarse para la expresión de polipéptidos recombinantes, a partir de tejido tumoral de pacientes (por ejemplo, células HeLa). Dichas células sin embargo no son adecuadas por consideraciones de seguridad y a causa de su inestabilidad genética para una producción industrial de polipéptidos terapéuticos para aplicación en seres humanos. Las líneas celulares humanas inmortalizadas espontáneamente no están prácticamente disponibles con pocas excepciones (por ejemplo, las denominadas células HaCaT). Son adecuadas con fines de producción biotecnológica en cambio las líneas celulares humanas permanentes que se generan mediante transformación de tejido primario mediante determinados productos génicos víricos. Mediante la expresión de polipéptidos transformantes de virus de ADN, pueden convertirse células primarias en células en crecimiento permanente. El mecanismo de transformación requiere la interacción de los productos génicos codificados por virus con proteínas celulares que participan en la regulación de la división celular (denominados productos génicos supresores tumorales). Así, irrumpe un punto de detención del ciclo celular (fase G0/G1) y las células pasan a la fase S, lo que conduce a una proliferación incontrolada de las células (Helt & Falloway, Carcinogenesis 24:159-169, 2003). Son ejemplos de dichos productos génicos codificados por virus transformantes antígeno T del virus 40 de simio (SV40), E6/E7 del papilomavirus humano (HPV) o E1A/E1B de adenovirus. Estas proteínas víricas son comparables en su mecanismo de transformación: antígeno T, E6 y E1A inactivan los productos génicos de la familia de proteína de retinoblastoma celular (pRb), y antígeno T, E7 y E1B inactivan el supresor tumoral celular p53 (resumido en: zur Hausen, J. Natl. Cancer Inst., 92, 690-698, 2000; Ludlow, FASEB J. 7: 866-871, 1993; Moran, FASEB J. 7, 880-885, 1993). Las líneas celulares así transformadas se vuelven así cultivables de forma duradera y son especialmente adecuadas con fines de producción biotecnológica.

Sólo muy pocos tipos de células humanas se han transformado hasta ahora con la región génica E1 de adenovirus. Pertenecen a ellas células neuronales en tejido renal embrionario humano (HEK293) (Graham et al., J. Gen. Virol. 36: 59-74, 1977), células de retina embrionaria humana (documento EP 833.934 B1) y amniocitos humanos (documento EP 1.230.354 B1).

El procedimiento descrito de preparación de líneas celulares productoras basado en líneas celulares inmortalizadas o transformadas existentes tiene desventajas en distintos aspectos. La adición de antibióticos, productos quimioterapéuticos u otros reactivos de selección al medio de cultivo durante la fase de selección, y según las circunstancias también en la fase de expansión antes de la producción, eleva los costes del procedimiento de producción. Mediante costosos análisis del proceso de producción, así como del producto final, debe asegurarse y demostrarse...

1. Procedimiento para la preparación de una línea celular humana permanente, en el que se transfectan simultáneamente amniocitos aislados con