Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos usando cepas de la familia de enterobacteriáceas.

Un procedimiento para la preparación de L-treonina, en el que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) fermentación de los microorganismos de la familia de enterobacteriáceas que producen el L-aminoácidodeseado, y en los que se sobreexpresa el gen betB que codifica betaína aldehído deshidrogenasa(dependiente de NAD),

b) concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y

c) aislamiento del L-aminoácido deseado, con lo que los constituyentes del caldo de fermentación y/o labiomasa en su totalidad o en porciones (≥0 a 100%) de la misma permanecen en el producto.

Procedimiento para la preparación de L-aminoácidos usando cepas de la familia de enterobacteriáceas

Campo de la Invención

Esta invención se refiere a un procedimiento para la preparación de L-treonina usando cepas de la familia de enterobacteriáceas en las que el gen bet B y opcionalmente uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en aldB y aldH está/están sobreexpresados.

Técnica anterior

Los L-aminoácidos, en particular L-treonina, encuentran aplicación en medicina humana y en la industria farmacéutica, en la industria alimentaria y muy particularmente en nutrición animal.

Se sabe que los L-aminoácidos se preparan mediante fermentación de cepas de enterobacteriáceas, en particular Escherichia coli (E. coli) y Serratia marcescens. Debido a su gran importancia, están realizándose constantemente trabajos para mejorar los procedimientos de preparación. Las mejoras en los procedimientos pueden referirse a medidas de fermentación técnicas, tales como, por ejemplo, agitación y suministro de oxígeno, o a la composición de los medios nutrientes, tales como, por ejemplo, la concentración de azúcar durante la fermentación, o a la elaboración en la forma del producto, por ejemplo mediante cromatografía de intercambio iónico, o a las propiedades intrínsecas de productividad del microorganismo propiamente dicho.

Para mejorar las propiedades de productividad de estos microorganismos se usan métodos de mutagénesis, selección y selección de mutantes. De esta manera se obtienen cepas que son resistentes a antimetabolitos, tales como, por ejemplo, el análogo de treonina ácido a-amino-1-hidroxivalérico (AHV) , o que son auxótrofas con respecto a metabolitos de importancia reguladora y producen L-aminoácido, tal como, por ejemplo, L-treonina.

También se han utilizado desde hace algunos años métodos de tecnología de ADN recombinante para mejorar el linaje de cepas de la familia de enterobacteriáceas que producen L-aminoácidos, amplificando genes individuales de la biosíntesis de aminoácidos e investigando el efecto sobre la producción.

Objeto de la invención

El objetivo de los inventores fue proporcionar nuevas medidas para la preparación mejorada de L-treonina.

Sumario de la invención

La invención proporciona un procedimiento para la preparación de L-treonina, usando microorganismos de la familia de enterobacteriáceas que, en particular, ya producen L-aminoácidos, y en los que el gen bet B y opcionalmente una

o más de las secuencias nucleotídicas que codifican los productos génicos de aldB y aldH están sobreexpresadas.

Descripción detallada de la invención

El término “intensificación” describe en este contexto el incremento de la actividad intracelular de una o más enzimas

o proteínas en un microorganismo que están codificadas por el ADN correspondiente, por ejemplo incrementando el número de copias del gen o genes, usando un promotor fuerte o un gen o alelo que codifica una enzima o proteína correspondiente que tiene una actividad elevada, y opcionalmente combinando estas medidas.

Mediante las medidas de intensificación, en particular sobreexpresión, la actividad o concentración de la proteína correspondiente se incrementa generalmente en al menos 10%, 25%, 50%, 75%, 100%, 150%, 200%, 300%, 400% o 500%, y como máximo hasta 1000% o 2000%, con respecto a la proteína de tipo salvaje o la actividad o concentración de la proteína en el microorganismo inicial.

El procedimiento se caracteriza porque se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) fermentación de los microorganismos de la familia de enterobacteriáceas que producen L-treonina, y en los que el gen betB y opcionalmente uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en aldB y aldH está/están sobreexpresados,

b) concentración de la L-treonina deseada en el medio o en las células de los microorganismos, y

c) aislamiento del L-aminoácido deseado, con lo que los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones (º0 a 100%) de la misma permanecen en el producto.

Los microorganismos proporcionados por la presente invención pueden producir L-treonina a partir de glucosa, sacarosa, lactosa, fructosa, maltosa, melazas, opcionalmente almidón, opcionalmente celulosa, o a partir de glicerol y etanol. Dichos microorganismos son representativos de la familia de enterobacteriáceas seleccionados de los géneros Escherichia, Erwinia, Providencia y Serratia. Se prefieren los géneros Escherichia y Serratia. Del género

Escherichia puede mencionarse en particular la especie Escherichia coli, y del género Serratia la especie Serratia marcescens.

Las cepas adecuadas del género Escherichia que producen en particular L-treonina, particularmente de la especie Escherichia coli, son, por ejemplo:

Escherichia coli TF427 Escherichia coli H4578 Escherichia coli KY10935 Escherichia coli VNIIgenetika MG442 Escherichia coli VNIIgenetika M1 Escherichia coli VNIIgenetika 472T23 Escherichia coli BKIIM B-3996 Escherichia coli kat 13 Escherichia coli KCCM-10132.

Las cepas adecuadas del género Serratia productoras de L-treonina, en particular de la especie Serratia marcescens, son, por ejemplo:

Serratia marcescens HNr21 Serratia marcescens TLr156 Serratia marcescens T2000.

Las cepas de la familia de enterobacteriáceas que producen L-treonina tienen preferiblemente, entre otras, una o más características genéticas o fenotípicas seleccionadas del grupo que comprende: resistencia a ácido a-amino-1hidroxivalérico, resistencia a tialisina, resistencia a etionina, resistencia a a-metilserina, resistencia a ácido diaminosuccínico, resistencia a ácido a-aminobutírico, resistencia a borrelidina, resistencia a rifampicina, resistencia a análogos de valina tales como, por ejemplo, hidroxamato de valina, resistencia a análogos de purina tales como, por ejemplo, 6-dimetilaminopurina, necesidad de L-metionina, opcionalmente una necesidad parcial y compensable de L-isoleucina, necesidad de ácido meso-diaminopimélico, auxotrofia con respecto a dipéptidos que contienen treonina, resistencia a L-treonina, resistencia a L-homoserina, resistencia a L-lisina, resistencia a L-metionina, resistencia a ácido L-glutámico, resistencia a L-aspartato, resistencia a L-leucina, resistencia a L-fenilalanina, resistencia a L-serina, resistencia a L-cisteína, resistencia a L-valina, sensibilidad a fluoropiruvato, deficiencia en treonina deshidrogenasa, opcionalmente una capacidad para utilización de sacarosa, intensificación del operón de treonina, intensificación de homoserina deshidrogenasa I-aspartato cinasa I, preferiblemente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de homoserina cinasa, intensificación de treonina sintasa, intensificación de aspartato cinasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de aspartato semialdehído deshidrogenasa, intensificación de fosfoenol piruvato carboxilasa, opcionalmente de la forma resistente a la realimentación, intensificación de fosfoenol piruvato sintasa, intensificación de transhidrogenasa, intensificación del producto del gen RhtB, intensificación del producto del gen RhtC, intensificación del producto del gen YfiK, intensificación de una piruvato carboxilasa, y atenuación de la formación de ácido acético.

Se ha encontrado que microorganismos de la familia de enterobacteriáceas producen L-treonina, de manera mejorada después de sobreexpresión, del gen bet B y opcionalmente uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en aldB y aldH.

Las secuencias nucleotídicas de los genes de Escherichia coli pertenecen a la técnica anterior (véanse las referencias de texto siguientes) , y también pueden encontrarse en la secuencia genómica de Escherichia coli publicada por Blattner et al. (Science 277: 1453-1462 (1997) ) .

Los genes aldA, aldB, aldH y betB se describen, entre otros, mediante los siguientes datos:

Gen aldA:

Descripción: Aldehído deshidrogenasa, dependiente de NAD

EC No.: 1.2.1.22

Referencia: Hidalgo et al.; Journal of Bacteriology 173 (19) : 6118-6123 (1991) Limon et al.;... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de L-treonina, en el que se llevan a cabo las siguientes etapas:

a) fermentación de los microorganismos de la familia de enterobacteriáceas que producen el L-aminoácido deseado, y en los que se sobreexpresa el gen betB que codifica betaína aldehído deshidrogenasa (dependiente de NAD) ,

b) concentración del L-aminoácido deseado en el medio o en las células de los microorganismos, y

c) aislamiento del L-aminoácido deseado, con lo que los constituyentes del caldo de fermentación y/o la biomasa en su totalidad o en porciones ( 0 a 100%) de la misma permanecen en el producto.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que se sobreexpresan los polinucleótidos de uno o más genes de seleccionados del grupo que consiste en aldB y aldH, con lo que aldB codifica aldehído deshidrogenasa B, y aldH codifica aldehído deshidrogenasa, dependiente de NADP.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que, para la preparación de L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia de enterobacteriáceas, en los cuales al mismo tiempo se sobreexpresa adicionalmente uno o más de los genes seleccionados del grupo que comprende:

3.1 el operón thrABC que codifica aspartato cinasa, homoserina deshidrogenasa, homoserina cinasa y treonina sintasa,

3.2 el gen pyc que codifica piruvato carboxilasa,

3.3 el gen pps que codifica fosfoenol piruvato sintasa,

3.4 el gen ppc que codifica fosfoenol piruvato carboxilasa,

3.5 los genes pntA y pntB que codifican transhidrogenasa,

3.6 el gen rhtB de Escherichia coli que codifica una proteína que proporciona resistencia a homoserina,

3.7 el gen mqo que codifica malato:quinona oxidorreductasa,

3.8 el gen rhtC de Escherichia coli que codifica una proteína que proporciona resistencia a treonina,

3.9 el gen thrE que codifica la proteína exportadora de treonina,

3.10 el gen gdhA que codifica glutamato deshidrogenasa,

3.11 el gen hns que codifica la proteína de unión a ADN HLP-II,

3.12 el gen pgm que codifica fosfoglucoisomerasa,

3.13 el gen fba que codifica fructosa bifosfato aldolasa,

3.14 el gen ptsH que codifica la fosfohistidina proteína hexosa fosfotransferasa,

3.15 el gen ptsI que codifica la enzima I del sistema de fosfotransferasa,

3.16 el gen crr que codifica el componente IIa específico de glucosa,

3.17 el gen ptsG que codifica el componente IIBC específico de glucosa,

3.18 el gen lrp que codifica el regulador del regulón leucina,

3.19 el gen csrA que codifica el regulador global Csr,

3.20 el gen fadR que codifica el regulador FadR del metabolismo de ácidos grasos y acetato,

3.21 el gen icIR que codifica el regulador IcIR,

3.22 el gen mopB que codifica la chaperona de 10 Kd,

3.23 el gen ahpC que codifica la subunidad pequeña de la alquil hidroperóxido reductasa,

3.24 el gen ahpF que codifica la subunidad grande de la alquil hidroperóxido reductasa,

3.25 el gen cysK que codifica cisteína sintasa A,

3.26 el gen cysB que codifica el regulador del regulón cys,

3.27 el gen cysJ que codifica la flavoproteína de la NADPH sulfito reductasa,

3.28 el gen cysI que codifica la hemoproteína de NADPH sulfito reductasa,

3.29 el gen cysH que codifica adenilil sulfato reductasa,

3.30 el gen phoB que codifica el regulador positivo PhoB del regulón pho,

3.31 el gen phoR que codifica la proteína sensora del regulón pho,

3.32 el gen phoE que codifica la proteína E de la membrana celular externa,

3.33 el gen pykF que codifica piruvato cinasa I estimulada por fructosa,

3.34 el gen pkfB que codifica 6-fosfofructocinasa II,

3.35 el gen malE que codifica la proteína de union periplásmica del transporte de maltosa,

3.36 el gen rseA que codifica una proteína de membrana que actúa como un regulador negativo de la actividad sigmaE,

3.37 el gen rseC que codifica un regulador global del factor sigmaE,

3.38 el gen sodA que codifica superóxido dismutasa,

3.39 el gen sucA que codifica la subunidad descarboxilasa de 2-cetoglutarato deshidrogenasa,

3.40 el gen sucB que codifica la subunidad dihidrolipoiltranssuccinasa E2 de 2-cetoglutarato deshidrogenasa,

3.41 el gen sucC que codifica la subunidad 1 de succinil-CoA sintetasa, y

3.42 el gen sucD que codifica la subunidad a de succinil-CoA sintetasa.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que, para la preparación de L-treonina, se fermentan microorganismos de la familia de enterobacteriáceas, en los cuales al mismo tiempo se elimina adicionalmente uno o más de los genes seleccionados del grupo que comprende:

4.1 el gen tdh que codifica treonina deshidrogenasa,

4.2 el gen mdh que codifica malato deshidrogenasa,

4.3 el producto génico del marco de lectura abierto (orf) yjfA de E. coli, cuando dicho microorganismo es de la especie E. coli,

4.4 el producto génico del marco de lectura abierto (orf) ytfP de E. coli, cuando dicho microorganismo es de la especie E. coli,

4.5 el gen pckA que codifica fosfoenolpiruvato carboxicinasa,

4.6 el gen poxB que codifica piruvato oxidasa,

4.7 el gen aceA que codifica isocitrato liasa,

4.8 el gen dgsA que codifica el regulador DgsA del sistema de fosfotransferasa,

4.9 el gen fruR que codifica el represor de fructosa,

4.10 el gen rpoS que codifica el factor sigma38,

4.11 el gen aspA que codifica aspartato amonio liasa (aspartasa) , y

4.12 el gen aceB que codifica malato sintasa A.

5. Microorganismos transformados del género Escherichia, en los que el gen betB y uno o más de los genes seleccionados del grupo que consiste en aldB y aldH están presentes en forma sobreexpresada, y que producen Ltreonina.

6. Microorganismos según la reivindicación 5, en los que los microorganismos son de la especie E. coli.