Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España.

Inventos patentados en España en los últimos 80 años. Clasificación Internacional de Patentes CIP 2013.

PROCEDIMIENTO DE PREPARACIÓN DE CULTIVOS LIBRES DE GLUTEN DEL GÉNERO PENICILLIUM, Y SU USO EN PRODUCTOS LÁCTEOS CON VETEADO AZUL.

Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen:

Un procedimiento para la preparación de una composición que incluye al menos un cultivo de mildiu o espora libre de gluten

, siendo dicho cultivo del género Penicillium y habiéndose obtenido mediante un substrato de cultivo libre de gluten, caracterizado porque dicha composición está sometida además a un tratamiento enzimático para la eliminación de las trazas de gluten.

Solicitante: MOFIN S.R.L.

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: VIA PIETRO CUSTODI, 12 28100 NOVARA ITALIA.

Inventor/es: MOGNA,GIOVANNI, STROZZI,GIAN PAOLO, BRUNO,FEDERICO.

Fecha de Publicación de la Concesión: 1 de Febrero de 2011.

Fecha Solicitud PCT: 26 de Julio de 2006.

Fecha Concesión Europea: 8 de Septiembre de 2010.

Clasificación PCT: A23C19/032 (..caracterizada por el empleo de microorganismos específicos o de enzimas de origen microbiano [3]), C12R1/80 (..Penicillium [3]).

Países PCT: Austria, Bélgica, Suiza, Alemania, Dinamarca, España, Francia, Reino Unido, Grecia, Italia, Liechtensein, Luxemburgo, Países Bajos, Suecia, Mónaco, Portugal, Irlanda, Eslovenia, Finlandia, Rumania, Chipre, Lituania, Letonia, Ex República Yugoslava de Macedonia, Albania.

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Descripción:

La presente invención se refiere a cultivos de mildius o esporas “libres de gluten” del género Penicillium, en particular de las especies Penicillium roqueforti, para el veteado azul de quesos destinados para personas afectadas por enfermedad celíaca.

El objetivo de la presente invención es un procedimiento para la preparación de dichos cultivos libres de gluten que prevé el uso de un substrato de cultivo analérgico libre de gluten, asociado con un tratamiento enzimático subsiguiente adecuado para la completa eliminación de trazas de gluten, si es que existe alguna, provenientes de contaminación accidental y no intencionada (contaminaciones cruzadas).

La enfermedad celiaca es una enfermedad inflamatoria inmuno-mediada, crónica, enteropática, surgida de la ingestión de gluten, una proteína “almacén” contenida de manera natural en algunos cereales. Esta intolerancia alimenticia afecta a personas genéticamente predispuestas, de cualquier edad, que tienen un sistema inmune que responde de un modo anormal a la ingestión de fracciones proteínicas típicas del gluten del trigo, escanda común (un tipo de trigo), kamut (Triticum turgidum) y “spel” (un tipo de trigo), cebada, arroz, triticale (un cruce entre trigo y arroz) y sus derivados. Algunos individuos también presentan intolerancia a las proteínas de la avena. Técnicamente, el término “gluten” se aplica a la combinación de las proteínas prolamínicas (ricas en prolina) simples, denominadas “gliadinas”, y glutelínicas (ricas en glutamina), denominadas “gluteninas”, de los cereales anteriormente mencionados. En el contexto de la enfermedad celíaca, el término “gluten” se usa frecuentemente con referencia a todos los tipos de proteínas contenidas en los cereales, incluso si entre las diferentes fracciones proteínicas que forman el gluten, la gliadina parece ser la más perjudicial.

La enfermedad celíaca puede producirse en múltiples formas clínicas, no siempre en una forma manifiesta; de hecho, existen síntomas clínicamente silentes y sin evidencia, latentes o potenciales, formas mono-sintomáticas, o con un síntoma clínico intestinal y extra-intestinal completo. La inflamación crónica conduce al incremento de los linfocitos intraepiteliales intestinales, a la hipertrofia de las criptas y al progresivo aplastamiento y desaparición de la vellosidad intestinal del intestino delgado, en particular la mucosa duodenal, con una consiguiente pérdida de capacidad de absorción de las substancias nutritivas y la aparición de síntomas tales como diarrea crónica, distensión abdominal, inapetencia, disminución de peso, anemia y deficiencia vitamínica. En los casos más serios, contramarcados con una diagnosis tardía, puede producirse osteoporosis, infertilidad, abortos repetidos, baja altura en las personas jóvenes, diabetes mellitus, tiroiditis autoinmune, alopecia, epilepsia con calcificaciones cerebrales y linfoma intestinal terrible. En las personas celíacas, la ingesta de gluten, también en pequeñas cantidades, es capaz de causar la respuesta anormal del sistema inmune: la transglutaminasa, una enzima que existe en el tejido mucoso intestinal, se une ella misma a la gliadina y, a través de la desaminación, se transforma en una molécula capaz de activar las células T (células del sistema inmune capaces de mediar todas las respuestas inmunes hacia los antígenos proteínicos), con una consiguiente producción de inmunoglobulinas IgG y IgA antitransglutaminasa e IgA anti-endomisa. En una primera fase, se produce un incremento de las células T activadas intraepiteliales intestinales, en tanto que con el progreso de la enfermedad el incremento se refiere tanto a los linfocitos como a las células de plasma infiltradas de la propia lámina, con una producción de metaloproteinasas responsables del acortamiento de la vellosidad y, en consecuencia, del daño a la mucosa intestinal.

La posibilidad de prevenir el desarrollo o el tratamiento de la enfermedad celíaca no existe hasta ahora, en consecuencia, una dieta libre de gluten, estrictamente llevada a lo largo de la vida es la única terapia capaz de asegurar a las personas celíacas una salud perfecta. Las personas celíacas deben eliminar igualmente las más pequeñas trazas de harina de los cereales peligrosos, puesto que la ingesta de gluten, incluso en cantidades mínimas, puede desencadenar la respuesta autoinmune. Puesto que la relación de la cantidad de gluten ingerido con respecto al efecto tóxico inducido a nivel intestinal no ha sido aún definido, el término “trazas”, desde el punto de vista cuantitativo, tiene una importancia práctica fundamental en el tratamiento de la enfermedad celíaca y las implicaciones sobre el plan de legislación alimentaria, dado que dichas “trazas” están relacionadas con el límite máximo de gluten “aceptable” (umbral) en los productos adecuados para la dieta de la persona celíaca. Todas las personas expertas están de acuerdo en que una dosis de 100 mg por día de gliadina, igual a 200 mg de gluten, es decir, aproximadamente 3 g de pan, es suficiente para causar, en la mayoría de las personas celíacas, el incremento de los linfocitos intraepiteliales intestinales, un signo prematuro de inflamación intestinal persistente.

Con referencia al umbral mínimo, los pocos trabajos científicos llevados a cabo hasta ahora parecerían mostrar que la ingestión de hasta 10 miligramos por día de gliadina (igual a 20 partes por millón de gluten) no es capaz de dañar sensiblemente la mucosa intestinal, pero puede determinar, en una minoría de los casos, la aparición de síntomas gastroentéricos.

A nivel legislativo internacional, la antigua norma “Codex Standard for Gluten-Free Foods”, por otra parte aún en vigor, muestra, como el contenido en gluten máximo en los productos de dieta terapéutica, 0,05 de nitrógeno por 100 g de producto seco (con referencia al almidón del trigo), lo cual se corresponde con una fracción de gluten igual a aproximadamente 500 ppm. Sin embargo, se está llevando a efecto una revisión apropiada y correcta de la directriz anteriormente indicada, la cual parece prever que los alimentos libres de gluten que resultan de ingredientes libres de gluten de manera natural no contengan más de 20 ppm de gluten, mientras que los alimentos libres de gluten obtenidos de cereales con gluten, pueden tener un límite máximo de 200 ppm de gluten.

En Francia, Gran Bretaña y los Países Bajos, los cuales están esperando la revisión de la directriz anteriormente indicada, consideran, como el límite máximo para los productos libres de gluten, 200 partes por millón. En Italia, entrará en vigor una ley (Legislative Decree n. 109/1992), que establece que, si en la composición del producto alimentario o en la de uno o más de los ingredientes (aromatizantes, aditivos o co-adyuvantes) que forman el mismo, están presentes cereales que contienen gluten o substancias obtenidas del mismo y/o procedentes del procedimiento productivo puede obtenerse en el producto final una cantidad de gluten, determinada analíticamente como superior a 20 partes por millón, dicho producto tendrá que mostrar en la etiqueta, al pie de la lista de los ingredientes y de una manera bien visible, las palabras “producto que contiene gluten”.

En consecuencia, con el fin de asegurar a las personas celíacas una información precisa sobre la ausencia de gluten en los alimentos, será obligatorio, también en los quesos, mostrar en la etiqueta la presencia de posibles trazas de gluten.

Para la industria láctea especializada en la producción de quesos veteados azules, este nuevo aspecto regulador implica un serio daño comercial derivado de la disminución del círculo potencial de compradores consumidores. Sin embargo, la completa exclusión del gluten de la dieta no es fácil de llevar a cabo, considerando que pueden producirse fenómenos de contaminación cruzada de cereales y derivados (almidones, harinas, harina de almidón, etc.) libres de gluten de manera natural, previamente a nivel de la industria de molturación.

Dichos productos son usados, a continuación, por la industria alimentaria en la preparación de alimentos complejos basados en múltiples ingredientes tecnológicos, aditivos y coadyuvantes de diferente origen y naturaleza. Una reciente investigación ha mostrado que hasta el 6% de los productos “teóricamente” libres de gluten, en base al ingrediente reportado, contienen realmente por encima de 30 mg de gliadina por 100 g del producto final, igual a 600 ppm de gluten. Para el fin de exclusión de una posible contaminación por gluten, es necesario, en consecuencia, considerar, para cada producto alimentario comercializado, no solamente todos los ingredientes usados y el procedimiento, sino también la cadena productiva de cada ingrediente individual.

Entre los “alimentos en riesgo”, como igualmente señalados por la Asociación Italiana de Personas Celíacas, los “quesos veteados azules y con una corteza mohosa” están también incluidos, puesto que a partir de investigaciones experimentales, llevadas a cabo igualmente en Italia, resulta que algunos “quesos veteados azules y con una corteza mohosa” pueden contener gluten proveniente de medios de cultivo de desarrollo de esquizomicetos (mildius y levaduras) usados como cultivos de partida con el fin de obtener el veteado azul típico del queso azul (Penicillium roqueforti), el recubrimiento de fieltro blanco de quesos tales como Brie, Camembert y Carré de l'Est, Tomme blanche (Penicillium candidum) y/o el refinado de muchos otros tipos de quesos (géneros Kluiveromices, Debaromices).

De acuerdo con la reglamentación que entrará en vigor, nacida con el fin de satisfacer la necesidad de las personas celíacas de una información precisa sobre la ausencia de gluten en los alimentos, si dichos quesos contienen trazas de gluten, o si de alguna forma están fabricados con ingredientes o co-adyuvantes que contienen gluten tecnológicos, será obligatorio mostrarlo en la etiqueta.

En consecuencia, existe una fuerte necesidad de ser capaces de proporcionar productos lácteos veteados azules “libres de gluten”.

La Solicitud de Patente FR-A1-2 447 682 divulga un procedimiento para la preparación de quesos usando cultivos P. roqueforti, los cuales se han desarrollado en un medio constituido de polvo de suero láctico, NH4Cl y agua.

Balszyk, M. y otros, en “Reduced water activity during sporogenesis in selected penicillia: Impact on spore quality”, Food Research International, vol. 31, no. 6-7, págs. 503-509, (1998), divulga una producción de esporas usando un medio que comprende un agar de dextrosa de patata (PDA). Para determinar el tiempo de germinación, se inocularon suspensiones de esporas con PDA.

Demyttenaere, J.C.R., y otros, en “De novo production of (+)-aristolochene by sporulated surface cultures of Penicillium roqueforti”, Phytochemistry, Pergamon Press, vol. 59, no. 6, págs. 597-602, March 2002 (2002-03), divulga un procedimiento de cultivo en el cual las cepas de P. roqueforti se cultivaron en un medio que comprende, entre otros, agar de extracto de patata (PDA) y agar de extracto de malta.

Strategies for spore production by Penicillium-Roquefortii using solid state fermentation techniques, en “Strategies for spore production by Penicillium-Roquefortii using solid state fermentation techniques”, Process Biochemistry, Elsevier, divulga un procedimiento de cultivo que usa un medio que comprende diversos substratos almidonoides incluyendo avenas, sorgo, maíz, triticale, trigo, arroz, y cebada. Sin embargo, se divulga el uso de granos de trigo sarraceno para cultivos de P. roqueforti.

Igualmente, en el caso en que el procedimiento de fabricación de cultivos de Penicillium no prevea el uso ningún ingrediente o substancia que contenga gluten, es posible, sin embargo que, debido a contaminaciones cruzadas no intencionadas y accidentales, algunos componentes usados en el procedimiento productivo aporte trazas de gluten.

De acuerdo con ello, todos los operadores del sector están de acuerdo en que, hasta

ahora, existe una necesidad muy fuerte de proporcionar un procedimiento para la preparación de medios de cultivo adecuados para el desarrollo de los esquizomicetos (mildius o levaduras), usados como cultivos de partida con el fin de obtener el veteado azul de los quesos, capaz de usar un substrato no basado en el pan y, simultáneamente, capaz de reducir las contaminacio

5 nes cruzadas no intencionadas y accidentales, si se produjeran.

En particular, existe la necesidad de proporcionar un procedimiento para la preparación de medios de cultivo de desarrollo de los esquizomicetos (mildius y levaduras), usados como cultivos de partida con el fin de obtener el veteado azul de los quesos, el cual prevea un doble nivel de seguridad con relación a la ausencia de gluten.

10 Un objetivo de la presente invención es proporcionar un procedimiento para la preparación de medios de cultivo capaces de superar los límites de la técnica conocida y sea adecuado para ser destinado para personas afectadas por enfermedad celíaca de una manera segura. Estos y otros objetivos, los cuales resultarán evidentes a partir de la descripción detallada siguiente, han sido alcanzados por el Solicitante, el cual ha mejorado una metodología, la 15 cual incluye un doble nivel de seguridad con relación a la ausencia de gluten en los medios de

cultivo.

En particular, el Solicitante ha establecido una metodología que prevé: un primer procedimiento para la preparación de cultivos de mildius o esporas desarrolladas en un substrato de cultivo libre de gluten seleccionado de manera natural, capaz de salvaguardar completamente

20 la actividad biológica de las esporas de mildius y, en consecuencia, la capacidad de asegurar un veteado azul óptimo y, en consecuencia, la capacidad de asegurar un veteado azul óptimo y, a continuación, un segundo procedimiento que prevé un tratamiento enzimático de dichos cultivos. Los mildius que pertenecen a las especies Penicillium roqueforti, preferiblemente seleccionados a partir del grupo depositado por el Solicitante en el Collection Centre DSMZ (Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH; Braunsweig, Alemania) el 21.12.2005, forman un sujeto de la presente invención, en la cual dicho grupo está constituido por los microorganismos identificados por dicho Centre, con los números de registro reportados en la Tabla 1 siguiente:

Tabla 1

Nombre Instituto de registro Número de registro Fecha de registro Propietario Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17815 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17816 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17817 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17818 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17819 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17820 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17821 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17822 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17823 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17824 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17825 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17826 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17827 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17828 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17829 21.12.2005 MOFIN S.R.L. Penicillium roqueforti DSMZ DSM 17830 21.12.2005 MOFIN S.R.L.

tal como se reporta en la reivindicación independiente adjunta. Un procedimiento para la preparación de un cultivo de mildiu o espora libre de gluten, seleccionado entre el grupo anteriormente indicado, una composición que incluye al menos uno de dichos cultivos y el uso de al menos uno de dichos cultivos para la preparación de un producto lácteo veteado azul destinado para personas con enfermedad celíaca forman, por consiguiente, un objetivo de la presente invención, que tiene las características informadas en las reivindicaciones adjuntas.

10 El veteado azul, es decir el veteado con un color verde más o menos intenso típico del Gorgonzola (Italia), Roquefort, Bress Blue, Blue d'Auvergne, Sassenage y otros (Francia), Stilton (Inglaterra), Danablue (Dinamarca), Cabrales (España) y Bluecheese (USA), se obtiene mediante el desarroolo de un mildiu que pertenece al género Penicillium (especie Penicillium roqueforti), el cual se agrega voluntariamente a la leche en el momento del tratamiento, conjuntamente con enzimas lácteas y el cuajo. Las cepas de mildius, las cantidades de esporas y las técnicas de tratamiento varían de un queso a otro, pero todas las tipologías se caracterizan por un tipo de coagulación del cuajo láctico, con una naturaleza láctica tardía prevalente, con una coagulación húmeda y particularmente blanda y agrietada, con lento y progresivo drenaje. La acción enzimática de una microflora mezclada (bacterias lácticas, mildiu y frecuentemente levaduras) permite obtener, en tiempos relativamente cortos, pastas muy proteolizadas (con un coeficiente de maduración de aproximadamente 65%) caracterizadas por la presencia de diversas substancias aromáticas para la acción lipolítica llevada a cabo por el Penicillium sobre la materia grasa. Los agrietamientos, indispensables para el desarrollo del mildiu, son una consecuencia tanto de la acidificación llevada a cabo por las enzimas lácticas como por el desprendimiento del dióxido de carbono producido por las levaduras o bacterias hetero-fermentadas.

Durante la maduración, las formas están sometidas, en dos etapas diferentes, a la perforación de ambas caras con agujas apropiadas. La operación tiene como objetivo el permitir la entrada de aire y, en consecuencia de oxígeno, dentro de los agrietamientos que existen en la pasta.

Unicamente en un ambiente aireado, las esporas de Penicillium son capaces de desarrollarse por sí solas, mediante la formación, en primer lugar, de un entrelazado de hifas (micelio) que invaden los agujeros y las grietas y posteriormente producen los conidióforos que portan las esporas, con un color verde/azul más o menos intenso.

Es el color de las esporas el que caracteriza el aspecto típico del Gorgonzola y todos los otros quesos veteados azules, en tanto que las acciones proteolíticas y lipolíticas del mildiu causan la maduración del queso y la formación de las características sensoriales particulares.

Los cultivos de esporas de las diferentes cepas de Penicillium roqueforti usadas en el tratamiento son preparadas por laboratorios especializados, en una forma líquida o criodeseacada, de acuerdo con la técnica conocida para el experto en la técnica.

Realmente, se realiza la preparación de un cultivo intermedio, el cual prevé una siembra de las esporas de la cepa Penicillium (procedente de un tubo del Working Cell Bank) en un medio de cultivo de agar adecuado (por ejemplo agar de patata, agar de patata-dextrosa, agar de extracto de malta) y posterior incubación a 22-28ºC durante 5-10 días, con el fin de incrementar su número.

Una vez finalizado el desarrollo y la formación de esporas del cultivo intermedio (usualmente una semana) en uno de los medios de cultivos anteriormente descritos, con una pipeta estéril se retiran las esporas y recogen de la superficie del medio de agar.

En una realización particularmente preferida, dicho cultivo intermedio se obtiene mediante el desarrollo de esporas que pertenecen a las especies Penicillium roqueforti, seleccionadas entre el grupo anteriormente descrito y reivindicado en la reivindicación independiente adjunta.

Dichas esporas han sido aisladas a partir de un hábitat natural, preferiblemente a partir

de esencias de forraje.

Las esporas del cultivo intermedio, después de suspensión en un medio líquido estéril apropiado (solución fisiológica o los propios caldos de cultivo anteriormente descritos en la formulación sin agar) forman el inóculo para la producción del cultivo final.

El Solicitante ha encontrado ser útil el usar, como un substrato de desarrollo, al menos un substrato libre de gluten de manera natural de origen vegetal.

En la práctica, el Solicitante ha encontrado útil el uso, como un substrato de desarrollo, de uno o más substratos seleccionados entre el grupo que incluye: arroz, maíz, patata, mandioca, tapioca, castañas, guisantes, habas y legumbres libres de gluten de manera natural, en la forma de granos inflados o explotados (tales como palomitas de maíz), o en la forma de harinas como tales y/o precocinadas.

Con referencia a los tubérculos (patata, tapioca y mandioca) estos tienen que ser previamente cortados en pequeños cubos o tiras, dependiendo de la posibilidad; sin embargo, es posible también usar sus harinas, tanto como tales o precocinadas. Por el contrario, las legumbres (por ejemplo, habas, guisantes, judías y garbanzos) se usan como tales o en una forma seca. Sin embargo, es posible usar cualquier mezcla de las materias primas listadas hasta ahora. De manera ventajosa, el substrato se selecciona a partir de arroz y/o maíz; preferiblemente en la forma de un substrato inflado o explotado o en la forma de harina, usado solo y/o en todas las combinaciones simples y/o complejas previsibles.

El substrato preferido, constituido por arroz inflado y/o maíz explotado se introduce en recipientes de vidrio Pirex con una gran abertura, los cuales posteriormente se cierran con un algodón bacteriológico y se esterilizan en autoclave a 121ºC durante 20 minutos.

A continuación, capa recipiente se inocula con una suspensión de esporas del cultivo de Penicillium y se introducen para la incubación, conjuntamente con otras muchas suspensiones idénticas que forman un único lote de producción, en termostatos con una temperatura controlada que varía desde 20 hasta 28ºC, en función de las cepas usadas.

La naturaleza del substrato de cultivo y las condiciones de incubación permiten el paso desde la forma de espora quiescente a la forma vegetativa; la espora germina y a partir de cada una, se forman células (hifas), las cuales producen enzimas capaces de transformar las substancias complejas que existen en el substrato anteriormente mencionado en moléculas más simples, las cuales son absorbidas por las células y determinan un desarrollo completo del mismo.

Cada hifa se extiende y segmenta por sí misma desarrollando dos células hija las cuales perpetran el mecanismo, dando lugar en unos pocos días a largos filamentos.

A partir del mayor o menor íntimo entrelazado de las hifas, se forma un tipo de fieltro de color blanco-parduzco (micelio), el cual, a continuación, cuando alcanza un nivel de desarrollo bien preciso y cuando las condiciones ambientales son ventajosas, produce hifas particulares en forma de un “cepillo” (conidióforos) con los cuerpos del fruto, los cuales, a su vez, portan las esporas con un color verde/azul más o menos intenso.

El tiempo requerido para el mantenimiento de las esporas cambia de cepa a cepa, pero generalmente, usando pan como un substrato, el ciclo termina después de 12-21 días a partir del inóculo.

Cuando se ha completado el desarrollo, se separan uno o más substratos sujetos de la presente invención, completamente invadidos y recubiertos de micelio y esporas verdes, del recipiente con la ayuda de una solución estéril de agua, sal y agar y se someten a trituración, homogeneización y filtración en instalaciones adecuadas para la extracción de esporas. Al final del procedimiento, se obtiene un líquido de color verde/azul, en el cual están suspendidas las esporas de la cepa Penicillium producida.

La etapa de extracción está seguida por una etapa de normalización del título de esporas, un objetivo que se logra mediante la adición de una fracción adicional de solución estéril en agua, sal y agar hasta que se alcanza la misma densidad óptica de una muestra de referencia de la cepa, evaluada mediante comparación nefelométrica.

El procedimiento descrito anteriormente permite ya certificar al cultivo de Penicillium así fabricado como un cultivo “libre de gluten”, no habiéndose usado en ninguna etapa del procedimiento productivo ningún ingrediente, excipiente o substancia que contenga gluten de manera natural.

No obstante, con el fin de asegurar un nivel de seguridad adicional, el Solicitante ha asociado de manera ventajosa con dicha metodología de producción un tratamiento con enzimas proteolíticas capaces de degradar el gluten, si es que existe, procedente de contaminaciones cruzadas accidentales a ser llevado a cabo sobre la suspensión de esporas obtenida a partir de los substratos anteriormente descritos.

En consecuencia, con la presente invención el Solicitante es capaz de proporcionar una metodología que prevé un doble nivel de seguridad, capaz de eliminar igualmente el posible riesgo debido a la presencia de trazas de gluten motivadas por contaminaciones cruzadas ocurridas a lo largo de la cadena de producción de las materias primas usadas.

El tratamiento enzimático, sujeto de la presente invención, ha sido definido después de haberse evaluado múltiples enzimas proteolíticas, tanto proteasas como peptidasas y sus mezclas, tales como tripsina, quimotripsina, pancreatina, pepsina, papaína y bromelaína.

De manera ventajosa, se usa pepsina y bromelaína, o mezclas de las dos enzimas, en una relación de desde 1:10 hasta 10:1 de las mismas; preferiblemente, en una relación en peso de desde 1:5 hasta 5:1.

La pepsina es una enzima contenida en el jugo gástrico que promueve la digestión de los alimentos. La pepsina es una proteasa que trabaja mejor en ambiente ácido y es capaz de romper las proteínas en muchos puntos diferentes y en desorden. Su acción hidrolítica es debida a un sitio activo que contiene dos restos de ácido aspártico. Es extraída, en particular, a partir de la mucosa gástrica de los cerdos, o a partir del cuarto estómago de los rumiantes, en particular bovinos. Se encuentra comercialmente disponible tanto en forma líquida como en polvo con un título diferente, expresado en Unidades Enzimáticas, o para el tipo bovino, usado en la industria láctea con el fin de coagular la leche y efectuar la maduración del queso, en MCU (Unidades de Coagulación de Leche).

La bromelaína es una mezcla proteinasa compleja generalmente extraída a partir del tronco de la piña, aunque están presentes en su pulpa enzimas similares. La bromelaína se encuentra disponible en polvo con una actividad enzimática expresada en GDU (Unidades de Digestión de Gelatina) o MCU (Unidades de Coagulación de Leche). 1 MCU es equivalente a aproximadamente 2/3 de GDU.

La hidrólisis del gluten tiene lugar intervalo bastante amplio de temperatura, desde 5 hasta 60ºC; preferiblemente, desde 30 hasta 50ºC. El valor del pH está entre 1 a 7; preferiblemente, desde 4 hasta 7. En particular, el pH para la pepsina está entre 1,8 a 6,0 y para la bromelaína el pH está entre 3,5 y 6,5.

De manera ventajosa, la temperatura está entre 30 y 40ºC; preferiblemente, es de 37ºC para la pepsina. De manera ventajosa, la temperatura está entre 40 y 50ºC; preferiblemente, es de 45ºC para la bromelaína.

El tiempo de hidrólisis es entre 5 a 60 horas, preferiblemente desde 15 hasta 50 horas.

Para la definición de las condiciones de trabajo con las cuales han de llevarse a cabo el tratamiento enzimático, adecuado para la eliminación de toda presencia de gluten en los cultivos de mildiu producidos con substancias libre de gluten de manera natural, se han realizado experimentos, en los cuales, a dichos cultivos se han agregado voluntariamente cantidades conocidas de gluten, con el fin de situar la concentración final en un intervalo que varía desde 3 hasta 20 ppm. Dichas concentraciones de gluten simulan la situación más seria que podría ocurrir después de contaminaciones cruzadas ocurridas en la cadena de producción de los alimentos y substancias libres de gluten de manera natural, usadas como substancias de desarrollo para el mildiu.

En los experimentos, llevados a cabo con el fin de hidrolizar el gluten voluntariamente agregado, se ha usado pepsina líquida con un título entre 300 y 800 MCU, de manera ventajosa con un título igual a 500 MCU, y bromelaína en polvo con un título entre 1550 a 3000 GDU, de manera ventajosa con un título igual a 2.200 GDU.

Se han llevado a cabo diversos ensayos, variando de vez en cuando la concentración final de las enzimas, usadas solas y mezcladas, o las condiciones de trabajo de la hidrólisis (temperatura, pH del mildiu y tiempo de acción).

La eliminación completa de la cantidad máxima de gluten agregado, igual a 20 ppm, se ha llevado a cabo preferiblemente con el uso simultáneo de pepsina (con un título igual a 500 MCU) y bromelaína (con un título igual a 2.200 MCU), para una duración total de 20-28 horas, por ejemplo 24 horas, con una temperatura entre 24 y 30ºC a un pH controlado entre 4 y 5. Después del tratamiento enzimático y la aprobación del lote por el Control de calidad, se lleva a cabo el envasado en recipientes estériles.

En base a la reglamentación Europea que entrará en vigor a finales de 2005, únicamente un queso veteado azul producido con mildius fabricados con la tecnología sujeto de la presente invención proporcionará garantías absolutas sobre la ausencia de gluten en él. En consecuencia, para este queso será innecesaria cualquier mención en la etiqueta concerniente a la presencia de gluten.

Aunque, en lo concerniente a las materias primas usadas como substancias de desarrollo, se han reportado ya un número suficiente de datos, más adelante se enumeran algunas realizaciones preferidas relativas al tratamiento enzimático meramente a modo de ejemplo, las cuales no limitan la importancia de la presente invención.

En estas realizaciones preferidas, las condiciones de trabajo son tales que la actividad biológica de las esporas de mildiu, y en consecuencia su capacidad para asegurar un óptimo veteado azul y maduración de los quesos azules, están protegidas.

Por ejemplo, en una realización preferida se usa:

a) concentración de bromelaína: desde 0,1 hasta 0,4 g/litro de mildiu (igual a 220-880 GDU/1); pH de la hidrólisis: 4,4-4,6; temperatura de la hidrólisis: 22-28ºC (por ejemplo, 24ºC); duración de la hidrólisis: 24-48 horas.

Por ejemplo, en otra realización preferida se usa:

b) concentración de pepsina: desde 0,2 hasta 0,4 g/litro de mildiu (igual a 100-200 MCU/1); pH de la hidrólisis: 4,4-4,6; temperatura de la hidrólisis: 22-28ºC (por ejemplo, 24ºC); duración de la hidrólisis: 24-48 horas.

Por ejemplo, en otra realización aún preferida se usa:

c) concentración de bromelaína: desde 0,05 hasta 0,2 g/litro de mildiu (igual a 110-440 DU/l); concentración de pepsina: desde 0,1 hasta 0,2 ml/litro de mildiu (igual a 50-100 MCU/1); pH de la hidrólisis: 4,4-4,6; temperatura de la hidrólisis: 22-28ºC (por ejemplo, 24ºC); duración de la hidrólisis: 24-48 horas.

De manera ventajosa, con el procedimiento sujeto de la presente invención, la cantidad

final de gluten determinada con el ensayo más sensible actualmente comercialmente disponible, siempre resulta no determinable. En este caso, es posible asegurar la ausencia de gluten en los cultivos producidos con la metodología de la presente invención. Los controles analíticos relativos a las concentraciones de gluten han sido llevados a cabo con el kit de gliadina ELISA 5 RIDASCREEN® de R-Biopharm A, Darmstadt, Alemania, para el análisis cuantitativo de la gliadina y las prolaminas correspondientes. A partir de periódico “Approaches to Establish Thresholds for Major Food Allergens and for Gluten in Food” – Draft Report of the U.S. Food and Drug Administration, Junio de 2005, puede concluirse que el kit analítico usado para la determinación de las concentraciones de gluten es uno de los pocos confirmados, el más sensible,

10 cuantitativo y específico para la diferentes gliadinas.




Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para la preparación de una composición que incluye al menos un cultivo de mildiu o espora libre de gluten, siendo dicho cultivo del género Penicillium y habién5 dose obtenido mediante un substrato de cultivo libre de gluten, caracterizado porque dicha composición está sometida además a un tratamiento enzimático para la eliminación de las trazas de gluten.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que dicho cultivo de mildius

o esporas pertenece a las especies Penicillium roqueforti; más preferiblemente, están seleccio10 nados entre el grupo de los 16 microorganismos siguientes:

Penicillium roqueforti DSM 17815 Penicillium roqueforti DSM 17816 Penicillium roqueforti DSM 17817 Penicillium roqueforti DSM 17818 Penicillium roqueforti DSM 17819 Penicillium roqueforti DSM 17820 Penicillium roqueforti DSM 17821 Penicillium roqueforti DSM 17822 Penicillium roqueforti DSM 17823 Penicillium roqueforti DSM 17824 Penicillium roqueforti DSM 17825 Penicillium roqueforti DSM 17826 Penicillium roqueforti DSM 17827 Penicillium roqueforti DSM 17828 Penicillium roqueforti DSM 17829 Penicillium roqueforti DSM 17830

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el cultivo libre de gluten está seleccionados entre los de origen vegetal; preferiblemente, a partir del grupo que 15 incluye: arroz, maíz, patata, mandioca, tapioca, castañas, guisantes, habas, judías y legumbres libres de gluten de manera natural o sus mezclas; lo más preferiblemente, el substrato es una mezcla que incluye arroz y maíz.

4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que el substrato de cultivo está en la forma de granos inflados o explotados o en la forma de harinas como tales y/o pre

cocinadas.

5. El procedimiento de acuerdo con una o más de las reivindicaciones desde 1 hasta 4, que incluye al menos una etapa en la cual al menos un substrato de cultivo, de acuerdo con una o más de las reivindicaciones desde 1 hasta 4, se inocula con una suspensión de esporas intermedias de la especie Penicillium roqueforti, en el que la inoculación se lleva a cabo durante el tiempo requerido y bajo tales condiciones que se permite la maduración de las esporas; preferiblemente, dichas esporas están seleccionadas entre el grupo de acuerdo con la reivindicación 2.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que se prevé además una etapa de separación de una solución líquida, que contiene el cultivo de espora, procedente del substrato usado.

7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que se prevé además una etapa de deshidratación de dicha solución líquida para obtener el cultivo de espora en una forma criodesecada, pulverizada o en polvo.

8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las posibles trazas de gluten que existen en dicha composición procedentes de contaminaciones cruzadas, accidentales o no intencionadas, son sometidas a tratamiento enzimático.

9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que el tratamiento enzimático prevé el uso de al menos una enzima proteolítica, estando seleccionada preferiblemente dicha enzima proteolítica entre el grupo que incluye proteasas y peptidasas; preferiblemente, dichas proteasas y peptidasas están seleccionadas entre el grupo que incluye: tripsina, quimotripsina, pancreatina, pepsina, papaína y bromelaína; lo más preferiblemente, las proteasas y las peptidasas están seleccionadas entre pepsina y/o bromelaína.

10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que el tratamiento enzimático tiene lugar a un valor de pH entre 1 y 7, preferiblemente desde 4 hasta 5; a una temperatura entre 5 y 60ºC, preferiblemente desde 30 hasta 50ºC y en un tiempo entre 5 y 60 horas, preferiblemente desde 15 hasta 50 horas.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que dicho tratamiento enzimático se lleva a cabo con pepsina y/o bromelaína bajo las condiciones siguientes: pH entre 4,4 y 4,6; temperatura entre 22 y 28ºC; y un tiempo entre 24 y 48 horas.

12. Uso de un cultivo de espora libre de gluten del género Penicillium preparado de acuerdo con una o más de las reivindicaciones de 1 a 11, para la preparación de un producto lácteo veteado azul destinado para personas afectadas por enfermedad celíaca.

13. Uso de acuerdo con la reivindicación 12, en el que las esporas o mildius están seleccionadas entre el grupo de acuerdo con la reivindicación 2.





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