Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno termoestable.

Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador deoxígeno altamente purificado y termoestable,

incluyendo la composición farmacéutica que contiene un portador deoxígeno hemoglobina, consistiendo la hemoglobina esencialmente en hemoglobina tetramérica reticulada nopolimérica, y comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar sangre completa de mamífero que incluye al menos eritrocitos y plasma;

b) separar los eritrocitos del plasma en la sangre completa de mamífero;

c) filtrar los eritrocitos que se separaron del plasma para obtener una fracción de eritrocitos filtrados;

d) lavar la fracción de eritrocitos filtrados para retirar las impurezas proteicas plasmáticas, dando como resultadoeritrocitos lavados;

e) disgregar los eritrocitos lavados mediante una lisis hipotónica precisa y controlada durante 2 a 30 s o un tiempopor otro lado suficiente para lisar los eritrocitos en un aparato de citólisis instantánea, creando una disolución quecomprende un lisado de eritrocitos disgregados a un caudal de 50-1000 l/h;

f) efectuar una filtración para retirar al menos una parte del retenido de desecho del lisado;

g) extraer una primera disolución de hemoglobina del lisado;

h) efectuar un primer proceso de ultrafiltración usando un filtro de ultrafiltración configurado para retirar lasimpurezas que tienen un peso molecular mayor que la hemoglobina y para retirar adicionalmente cualquier virus yretenido de desecho residual de la primera disolución de hemoglobina, obteniéndose una segunda disolución dehemoglobina;

i) efectuar una cromatografía en columna de flujo continuo con la disolución de hemoglobina purificada para retirarlas impurezas proteicas;

j) efectuar un segundo proceso de ultrafiltración usando un filtro de ultrafiltración configurado para retirar impurezas ypara concentrar la disolución de hemoglobina;

k) reticular al menos las subunidades α-α de la hemoglobina con fumarato de bis-3,5-dibromosalicilo, formandohemoglobina reticulada en un entorno desoxigenado, en el que la hemoglobina reticulada es hemoglobinatetramérica reticulada no polimérica;

l) intercambiar un tampón fisiológico adecuado por la hemoglobina tetramérica reticulada;

m) retirar cualquier producto químico residual por filtración por flujo tangencial;

n) tratar térmicamente la hemoglobina reticulada en un entorno desoxigenado para desnaturalizar y precipitarcualquier hemoglobina no reaccionada residual, hemoglobina dimérica no estabilizada y cualquier otra impurezaproteica de tal modo que la hemoglobina tetramérica reticulada termoestable resultante tenga una concentraciónindetectable de dímero y consista esencialmente en hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica, en el que eltratamiento térmico se efectúa a 70 a 95ºC durante un tiempo de 30 s a 3 h en una o más de las siguientescondiciones:

n1) seguido inmediatamente por enfriamiento a aproximadamente 25ºC, y/o

n2) se añade N-acetilcisteína a la hemoglobina tetramérica reticulada antes del tratamiento térmico;

o) añadir N-acetilcisteína inmediatamente después de tratar térmicamente la hemoglobina tetramérica reticuladapara mantener un bajo nivel de metahemoglobina;

p) retirar el precipitado mediante una centrifugación o un aparato de filtración formando una disolución transparente;

y

q) añadir la hemoglobina tetramérica reticulada purificada y termoestable a un portador farmacéuticamenteaceptable.

Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno termoestable 5

Referencia cruzada a solicitudes relacionadas:

Esta solicitud reivindica prioridad de la solicitud de patente de EE.UU. nº de serie 12/821.214, presentada el 23 de junio de 2010, y de la solicitud de continuación en parte de patente de EE.UU. nº de serie 12/957.430, presentada el 1 de diciembre de 2010.

Notificación/permiso de derechos de autor

Una parte de la divulgación de este documento de patente contiene material que está sujeto a la protección de derechos de autor. El poseedor de los derechos de autor no tiene objeciones a la reproducción facsimilar de cualquiera de los documentos de patente o divulgaciones de patente como aparecen en el archivo o registros de patentes de la Oficina de Patentes y Marcas, pero se reserva por lo demás absolutamente todos los derechos de autor. La siguiente notificación se aplica a los procesos, experimentos y datos como se describen a continuación y a los dibujos adjuntos a los mismos: Copyright © 2010, Billion King International Limited, todos los derechos reservados.

Campo técnico [0003] La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de una composición 25 farmacéutica que contiene un portador de oxígeno termoestable y a la composición preparada mediante el proceso.

Se da a conocer también el uso de la composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno termoestable para el tratamiento de cáncer, trastornos por privación de oxígeno y conservación de órganos para seres humanos y otros animales.

Antecedentes de la invención [0005] La hemoglobina desempeña un papel importante en la mayoría de los vertebrados para el intercambio gaseoso entre el sistema vascular y los tejidos. Es responsable de portar oxígeno desde el sistema respiratorio a las células corporales mediante la circulación sanguínea y también de portar el producto de desecho metabólico dióxido de carbono fuera de las células corporales al sistema respiratorio, donde se exhala el dióxido de carbono. Puesto que la hemoglobina tiene este rasgo de transporte de oxígeno, puede usarse como un potente suministrador de oxígeno si puede estabilizarse ex vivo y usarse in vivo.

La hemoglobina de origen natural es un tetrámero que es generalmente estable cuando está presente en los eritrocitos. Sin embargo, cuando se retira la hemoglobina de origen natural de los eritrocitos, se vuelve inestable en el plasma y se escinde en dos dímeros a-º. Cada uno de estos dímeros es de un peso molecular de aproximadamente 32 kDa. Estos dímeros pueden causar una lesión renal sustancial cuando se filtran a través de los riñones y se excretan. La degradación del ligamiento del tetrámero influye negativamente también sobre la 45 sostenibilidad de la hemoglobina funcional en circulación.

Para resolver el problema, los desarrollos recientes en el procesamiento de hemoglobina han incorporado diversas técnicas de reticulación para crear enlaces intramoleculares en el tetrámero así como enlaces intermoleculares entre los tetrámeros, formando hemoglobina polimérica. La técnica anterior enseña que la 50 hemoglobina polimérica es la forma preferida para aumentar la semivida en circulación de la hemoglobina. Sin embargo, como se determina por los presentes inventores, la hemoglobina polimérica se convierte más fácilmente en metahemoglobina en la circulación sanguínea. La metahemoglobina no puede unir oxígeno y por lo tanto no puede oxigenar tejidos. Por lo tanto, la reticulación enseñada por la técnica anterior que causa la formación de hemoglobina polimérica es un problema. Existe la necesidad en la materia de una técnica que permita una 55 reticulación intramolecular para crear tetrámeros estables sin la formación simultánea de hemoglobina polimérica.

Los problemas adicionales con los intentos de la técnica anterior de estabilizar la hemoglobina incluyen la producción de hemoglobina tetramérica que incluye un porcentaje inaceptablemente alto de unidades diméricas; la presencia de dímeros hace a la composición de hemoglobina insatisfactoria para administración a mamíferos. La forma dimérica de la hemoglobina puede causar lesión renal grave a un cuerpo de mamífero, y esta lesión renal puede ser suficientemente grave para causar la muerte. Por lo tanto, existe la necesidad en la materia de crear hemoglobina tetramérica estable con una forma dimérica indetectable en el producto final.

Otro problema con los productos de hemoglobina de la técnica anterior es un aumento repentino de la presión sanguínea después de la administración. En el pasado, se han registrado eventos de vasoconstricción por portadores de oxígeno basados en hemoglobina de generaciones anteriores. Por ejemplo, el producto Hemopure® (Biopure Co., EE.UU.) daba como resultado una presión arterial media un 30% más alta (16, 5 ± 1, 2 kPa) cuando se comparaba con el valor basal (12, 8 ± 1, 3 kPa) como se da a conocer por Katz y col., 2010. Los intentos anteriores de resolver este problema se han basado en reactivos de sulfhidrilo que reaccionaban con grupos sulfhidrilo de hemoglobina, supuestamente para evitar la unión del factor de relajación derivado de endotelio con los grupos sulfhidrilo. Sin embargo, el uso de tratamiento de sulfhidrilo añade etapas de procesamiento, dando como resultado un coste añadido e impurezas que deben retirarse después de la composición de hemoglobina. Por tanto, existe la necesidad en la materia de un proceso para preparar hemoglobina que no cause vasoconstricción ni hipertensión cuando se aplica a un mamífero.

Los problemas adicionales con los intentos de la técnica anterior de crear hemoglobina estable incluyen la presencia de impurezas proteicas tales como inmunoglobulina G que pueden causar efectos alérgicos en mamíferos. Por lo tanto, existe la necesidad en la materia de un proceso que pueda producir hemoglobina tetramérica estable sin impurezas proteicas.

Además de los problemas anteriores, existe la necesidad en la materia de una hemoglobina tetramérica estabilizada que esté exenta de dímeros, exenta de fosfolípidos y pueda producirse a escala industrial.

Resumen de la invención [0012] La presente invención proporciona un procedimiento para procesar una hemoglobina tetramérica reticulada purificada termoestable no polimérica adecuada para uso en mamíferos sin causar lesión renal grave, efectos vasculares perjudiciales ni eventos adversos graves, incluyendo la muerte. La presente invención retira la 30 forma dimérica de hemoglobina, la hemoglobina tetramérica no reticulada, fosfolípidos e impurezas proteicas. Adicionalmente, la presente invención usa (1) un aparato de citólisis instantánea para una lisis hipotónica precisa y controlada, (2) una cromatografía en columna de flujo continuo continuo, (3) un aparato de alta temperatura/corto tiempo (ATCT) para procesamiento térmico de la disolución de hemoglobina en el proceso de purificación para retirar los dímeros de hemoglobina no estabilizados indeseables y para retirar las impurezas proteicas, por ejemplo inmunoglobulina G, de modo que puedan evitarse lesiones renales, efectos vasculares perjudiciales y otras reacciones tóxicas y (4) un envase de bolsa de infusión hermético para evitar la entrada de oxígeno al producto.

El procedimiento incluye un material de partida de sangre completa de mamífero que incluye al menos eritrocitos y plasma. Los eritrocitos se separan del plasma en la sangre completa de mamífero, seguido de filtración para obtener una fracción de eritrocitos filtrados. Se lava la fracción de eritrocitos filtrados para retirar las impurezas proteicas plasmáticas. Se disgregan los eritrocitos lavados mediante lisis hipotónica controlada durante un tiempo suficiente para lisar los eritrocitos sin lisar los leucocitos en un aparato de citólisis instantánea a un caudal de 501000 l/h. Se efectúa una filtración para retirar al menos una parte del retenido de desecho del lisado. Se extrae una primera disolución de hemoglobina del lisado.

Se efectúa un primer proceso de ultrafiltración usando un filtro de ultrafiltración configurado para retirar las impurezas que tienen un peso molecular mayor que la hemoglobina tetramérica y para retirar adicionalmente cualquier virus y retenido de desecho residual de la primera disolución de hemoglobina, obteniéndose una segunda disolución de hemoglobina. Se efectúa una cromatografía de columna de flujo continuo con la segunda disolución de 50 hemoglobina para retirar las impurezas proteicas, hemoglobina dimérica y fosfolípidos, formando una disolución de hemoglobina exenta de fosfolípidos. Se efectúa... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y termoestable, incluyendo la composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno hemoglobina, consistiendo la hemoglobina esencialmente en hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica, y comprendiendo el procedimiento:

a) proporcionar sangre completa de mamífero que incluye al menos eritrocitos y plasma;

b) separar los eritrocitos del plasma en la sangre completa de mamífero;

c) filtrar los eritrocitos que se separaron del plasma para obtener una fracción de eritrocitos filtrados;

d) lavar la fracción de eritrocitos filtrados para retirar las impurezas proteicas plasmáticas, dando como resultado 15 eritrocitos lavados;

e) disgregar los eritrocitos lavados mediante una lisis hipotónica precisa y controlada durante 2 a 30 s o un tiempo por otro lado suficiente para lisar los eritrocitos en un aparato de citólisis instantánea, creando una disolución que comprende un lisado de eritrocitos disgregados a un caudal d.

5. 1000 l/h;

f) efectuar una filtración para retirar al menos una parte del retenido de desecho del lisado;

g) extraer una primera disolución de hemoglobina del lisado;

h) efectuar un primer proceso de ultrafiltración usando un filtro de ultrafiltración configurado para retirar las impurezas que tienen un peso molecular mayor que la hemoglobina y para retirar adicionalmente cualquier virus y retenido de desecho residual de la primera disolución de hemoglobina, obteniéndose una segunda disolución de hemoglobina;

i) efectuar una cromatografía en columna de flujo continuo con la disolución de hemoglobina purificada para retirar las impurezas proteicas;

j) efectuar un segundo proceso de ultrafiltración usando un filtro de ultrafiltración configurado para retirar impurezas y para concentrar la disolución de hemoglobina;

k) reticular al menos las subunidades a-a de la hemoglobina con fumarato de bis-3, 5-dibromosalicilo, formando hemoglobina reticulada en un entorno desoxigenado, en el que la hemoglobina reticulada es hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica;

l) intercambiar un tampón fisiológico adecuado por la hemoglobina tetramérica reticulada;

m) retirar cualquier producto químico residual por filtración por flujo tangencial;

n) tratar térmicamente la hemoglobina reticulada en un entorno desoxigenado para desnaturalizar y precipitar

cualquier hemoglobina no reaccionada residual, hemoglobina dimérica no estabilizada y cualquier otra impureza proteica de tal modo que la hemoglobina tetramérica reticulada termoestable resultante tenga una concentración indetectable de dímero y consista esencialmente en hemoglobina tetramérica reticulada no polimérica, en el que el tratamiento térmico se efectúa a 70 a 95ºC durante un tiempo de 30 s a 3 h en una o más de las siguientes condiciones:

n1) seguido inmediatamente por enfriamiento a aproximadamente 25ºC, y/o n2) se añade N-acetilcisteína a la hemoglobina tetramérica reticulada antes del tratamiento térmico;

o) añadir N-acetilcisteína inmediatamente después de tratar térmicamente la hemoglobina tetramérica reticulada para mantener un bajo nivel de metahemoglobina;

p) retirar el precipitado mediante una centrifugación o un aparato de filtración formando una disolución transparente; y q) añadir la hemoglobina tetramérica reticulada purificada y termoestable a un portador farmacéuticamente aceptable.

2. El procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y termoestable según al reivindicación 1, en el que se añade N-acetilcisteína en una cantidad de 0, 2 a 0, 4% inmediatamente después de la etapa de enfriamiento n1.

3. El procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y termoestable según al reivindicación 1, en el que la adición de N-acetilcisteína antes del tratamiento térmico n2 es en una cantidad de aproximadamente 0, 2%.

4. El procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y termoestable según la reivindicación 1, en el que la sangre completa es sangre 15 completa humana, bovina, porcina, canina o equina.

5. El procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y termoestable según la reivindicación 1, en el que dicha cromatografía en columna comprende una o más columnas de intercambio catiónico o columnas de intercambio aniónico.

6. El procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y termoestable según la reivindicación 5, en el que la columna de cromatografía es una o más de columna de DEAE, columna de CM y/o columna de hidroxiapatito.

7. El procedimiento para la preparación de una composición farmacéutica que contiene un portador de oxígeno altamente purificado y termoestable según la reivindicación 1, en el que el portador farmacéuticamente aceptable es un tampón fisiológico o agua.