Un procedimiento para la preparación de ácido metacrílico o ésteres del ácido metacrílico.

Un procedimiento para la preparación de ácido metacrílico o ésteres del ácido metacrílico,

que comprende lasetapas de procedimiento

IA) preparación de ácido 3-hidroxiisobutírico mediante un procedimiento que comprende la etapa deprocedimiento de la puesta en contacto de una célula que fue modificada por tecnología genética conrespecto a su tipo salvaje, de modo que, en comparación con su tipo salvaje, es capaz de formar más ácido3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico, con un medio nutricio quecontiene como fuente de carbono hidratos de carbono, glicerol, dióxido de carbono, metano, metanol, Lvalinao L-glutamato, bajo condiciones en las que a partir de la fuente de carbono se forman ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico, eventual purificación delácido 3-hidroxiisobutírico a partir del medio nutricio, así como, eventualmente, neutralización del ácido 3-hidroxiisobutírico,

IB) deshidratación del ácido 3-hidroxiisobutírico bajo formación de ácido metacrílico, así como, eventualmente,esterificación del ácido metacrílico, en el que

1) la formación de ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados enácido 3-hidroxiisobutírico tiene lugar a través de metilmalonato-semiladehídoen calidad de producto previo.

Un procedimiento para la preparación de ácido metacrílico o ésteres del ácido metacrílico La presente invención se refiere a un procedimiento para la preparación de ácido metacrílico o ésteres del ácido metacrílico, así como a un procedimiento para la preparación de ácido polimetacrílico o ésteres del ácido polimetacrílico.

El ácido metacrílico es un importante producto intermedio que encuentra aplicación, en particular, en forma de sus ésteres alquílicos para la preparación de polímeros. Un derivado del ácido metacrílico conocido es, por ejemplo, el éster metílico del ácido metacrílico. Actualmente, la producción anual mundial de ésteres metílicos del ácido metacrílico asciende a aprox. 1, 5 millones de toneladas. Los ésteres del ácido polimetacrílico son materias primas empleables de manera variada en el sector de los materiales sintéticos.

La producción comercial de ácido metacrílico tiene lugar, habitualmente, mediante oxidación en fase gaseosa heterogénea, catalizada en dos etapas, de compuestos de carbono C4 tales como butileno, isobutileno, butano, isobutano, alcohol t-butílico o metacroleína a masas de óxidos de múltiples metales sólidas como catalizador. La mezcla gaseosa de producto obtenida con ello, la cual contiene, junto al ácido metacrílico, además numerosos productos secundarios, es sometida a continuación a una condensación total obteniéndose una disolución acuosa de ácido metacrílico, o es absorbida en una mezcla de disolventes adecuada. Después, le sigue habitualmente una purificación ulterior de las fases líquidas así obtenidas mediante destilación, cristalización, extracción o mediante una combinación de estas medidas. Junto a la oxidación en fase gaseosa catalítica de compuestos de carbono C4, el ácido metacrílico puede formarse también mediante una deshidrogenación catalítica oxidativa a partir de ácido isobutírico, tal como se describe, por ejemplo, en el documento EP-A-0 356 315. Otra posibilidad para la preparación de ácido metacrílico la ofrece el denominado “Proceso ACH”, el que acetocianhidrina y ácido sulfúrico se hacen reaccionar bajo la formación de metacrilamida como producto intermedio, la cual se hace reaccionar luego posteriormente con agua para formar ácido metacrílico. A continuación, tiene lugar una purificación por destilación del ácido metacrílico así obtenido. Este procedimiento se describe, por ejemplo, en el documento EP-A1 359 137.

El documento EP1186592 describe un procedimiento para la producción de metacrilatos en el que ácido αhidroxiisobutírico reacciona con un alcohol en presencia de un catalizador sólido. Por el contrario, el documento US 3.562.320 muestra la producción de ácido metacrílico en un procedimiento en el que el ácido αhidroxiisobutírico es deshidrogenado bajo la influencia de calor y un catalizador de sal metálica.

El inconveniente de estos procedimientos habituales para la preparación de ácido metacrílico estriba, entre otros, en que tanto en la preparación del ácido metacrílico propiamente dicho como también en las siguientes etapas de purificación por destilación se produce, en virtud de la elevada tendencia a la polimerización del ácido metacrílico por parte de las etapas de procedimiento térmicamente lastrantes, una formación de dímeros u oligómeros lo cual

está ligado, junto a la complejidad de purificación adicional, también con una pérdida de rendimiento.

La presente invención tuvo por misión superar los inconvenientes que resultan del estado conocido de la técnica.

En particular, la presente invención tuvo por misión indicar un procedimiento para la preparación de ácido 45 metacrílico, en el que el ácido metacrílico se pueda obtener con el menor número posible de etapas térmicamente lastrantes.

También, este procedimiento debía hacer posible preparar el ácido metacrílico a partir de materias primas renovables, en particular a partir de hidratos de carbono y/o a partir de glicerol.

Una contribución a la solución de los problemas precedentemente mencionados la ofrece un procedimiento para la preparación de ácido metacrílico o ésteres del ácido metacrílico, que comprende las etapas de procedimiento IA) preparación de ácido 3-hidroxiisobutírico mediante un procedimiento que comprende la etapa de 55 procedimiento de la puesta en contacto de una célula que fue modificada por tecnología genética con respecto a su tipo salvaje, de modo que, en comparación con su tipo salvaje, es capaz de formar más ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico, con un medio nutricio que contiene como fuente de carbono hidratos de carbono, glicerol, dióxido de carbono, metano, metanol, L-valina o L-glutamato, bajo condiciones en las que a partir de la fuente de carbono se forman 60 ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico, eventual purificación del ácido 3-hidroxiisobutírico a partir del medio nutricio, así como, eventualmente, neutralización del ácido 3-hidroxiisobutírico, teniendo lugar la formación del ácido 3-hidroxiisobutírico o de los polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico preferiblemente a través de metilmalonatosemialdehído o a través de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como producto previo;

IB) deshidratación del ácido 3-hidroxiisobutírico bajo formación de ácido metacrílico, así como, eventualmente, esterificación del ácido metacrílico.

En la medida en que la formación de ácido 3-hidroxiisobutírico o de polihidroxialcanoatos basados en ácido 3

hidroxiisobutírico tenga lugar a través de metilmalonato-semialdehído como producto previo, se prefiere, además, que la formación tenga lugar a través de succinil-coenzima A, propionil-coenzima A o acriloil-coenzima A, de manera particularmente preferida a través de succinil-coenzima A como producto intermedio adicional. En la medida en que la formación de ácido 3-hidroxiisobutírico o de polihidroxialcanoatos basados en ácido 3hidroxiisobutírico tenga lugar a través de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A como producto previo, se prefiere, además,

que la formación tenga lugar a través de isobutiril-coenzima A o a través de 3-hidroxibutiril-coenzima A, preferiblemente a través de 3-hidroxibutiril-coenzima A como otro producto intermedio.

La expresión “producto previo”, tal como se utiliza en esta memoria, define un compuesto químico el cual puede hacerse reaccionar en sólo una única etapa de reacción y por vía enzimática para formar ácido 3-hidroxiisobutírico,

mientras que la expresión “producto intermedio” define un compuesto químico que no puede hacerse reaccionar en sólo una etapa de reacción por vía enzimática para formar ácido 3-hidroxiisobutírico.

La expresión “ácido 3-hidroxiisobutírico”, tal como se utiliza en esta memoria, describe siempre el correspondiente ácido carboxílico C4 en la forma en la que se presenta después de la formación mediante los correspondientes microorganismos en función del valor del pH. La expresión comprende, por consiguiente, siempre la forma de ácido pura (ácido 3-hidroxiisobutírico) , la forma de base pura (3-hidroxiisobutirato) así como mezclas a base de la forma protonada y desprotonada del ácido. Además, la expresión “ácido 3-hidroxiisobutírico” comprende básicamente tanto el estereoisómero (R) como también el estereoisómero (S) , siendo particularmente preferido el estereoisómero (S) .

La formulación “de que es capaz de formar más ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico en comparación con su tipo salvaje” se refiere también al caso de que el tipo salvaje de la célula modificada por tecnología genética no sea capaz de formar en absoluto ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico, pero al menos cantidades detectables algunas de estos compuestos, y sólo puedan formarse cantidades detectables de estos componentes después de la modificación por tecnología genética.

Por un “tipo salvaje” de una célula se designa preferiblemente una célula, cuyo genoma se presenta en un estado tal como resulte de forma natural a través de la evolución. La expresión se utiliza tanto para la célula completa como también para genes individuales. Bajo la expresión “tipo salvaje” caen, por lo tanto, en particular no aquellas células o bien aquellos genes cuyas secuencias génicas hayan sido modificadas, al menos en parte, por el hombre mediante procedimientos recombinantes.

1. Un procedimiento para la preparación de ácido metacrílico o ésteres del ácido metacrílico, que comprende las etapas de procedimiento IA) preparación de ácido 3-hidroxiisobutírico mediante un procedimiento que comprende la etapa de procedimiento de la puesta en contacto de una célula que fue modificada por tecnología genética con respecto a su tipo salvaje, de modo que, en comparación con su tipo salvaje, es capaz de formar más ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico, con un medio nutricio que contiene como fuente de carbono hidratos de carbono, glicerol, dióxido de carbono, metano, metanol, Lvalina o L-glutamato, bajo condiciones en las que a partir de la fuente de carbono se forman ácido 3hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico, eventual purificación del ácido 3-hidroxiisobutírico a partir del medio nutricio, así como, eventualmente, neutralización del ácido 3hidroxiisobutírico,

IB) deshidratación del ácido 3-hidroxiisobutírico bajo formación de ácido metacrílico, así como, eventualmente, esterificación del ácido metacrílico, en el que 1) la formación de ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico tiene lugar a través de metilmalonato-semiladehído en calidad de producto previo, y en el que 1a) la célula es capaz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3

hidroxiisobutírico a través de succinil-coenzima A como producto intermedio, y en el que

1a1) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de una enzima E1 que cataliza la reacción de succinil-coenzima A para formar metilmalonilcoenzima A, y/o 1a2) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de al menos una de las siguientes enzimas E2 a E4:

-de una enzima E2 que cataliza la reacción de metilmalonil-coenzima A para formar metilmalonato,

-de una enzima E3 que cataliza la reacción de metilmalonato para formar metilmalonato-semialdehído,

-de una enzima E4 que cataliza la reacción de metilmalonato-semialdehído para formar 3-hidroxiisobutirato, o

1a3) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de al menos una de las siguientes enzimas E4, E5, E6 y E7:

-de una enzima E6 que cataliza la reacción de (R) -metilmalonil-coenzima A para formar (S) -metilmalonil-coenzima A,

-de una enzima E7 que cataliza la reacción de (S) -metilmalonil-coenzima A para formar propionil-coenzima A,

-de una enzima E5 que cataliza la reacción de propionil-coenzima A para formar metilmalonato-semialdehído,

-de una enzima E4 que cataliza la reacción de metilmalonato-semialdehído para formar ácido 3-hidroxiisobutírico, o

1a4) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de al menos una de las siguientes enzimas E4, E5 y E7:

-de una enzima E7 que cataliza la reacción de metilmalonil-coenzima A para formar propionil-coenzima A,

-de una enzima E5 que cataliza la reacción de propionil-coenzima A para formar metilmalonato-semialdehído,

-de una enzima E4 que cataliza la reacción de metilmalonato-semialdehído para formar ácido 3-hidroxiisobutírico, o

1a5) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de al menos una de las siguientes enzimas E28 y E46:

-de una enzima E46 que cataliza la reacción de L-glutamato para formar 2ºxoglutarato;

-de una enzima E28 que cataliza la reacción de 2-oxoglutarato para formar succinil-coenzima A, o

1b) la célula es capaz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3hidroxiisobutírico a través de propionil-coenzima A como producto intermedio, y en el que 1b1) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de al

menos una de las siguientes enzimas E4, E5 y E47 a E52:

- de una enzima E47 que cataliza la reacción de acetil-coenzima A para formar malonil-coenzima A,

- de una enzima E48 que cataliza la reacción de malonil-coenzima A para formar malonato-semialdehído,

- de una enzima E49 que cataliza la reacción de malonato-semialdehido para formar 3-hidroxipropionato,

- de una enzima E50 que cataliza la reacción de 3-hidroxipropionato para formar 3hidroxipropionil-coenzima A,

- de una enzima E51 que cataliza la reacción de 3-hidroxipropionil-coenzima A para formar acriloil-coenzima A,

- de una enzima E52 que cataliza la reacción de acriloil-coenzima A para formar propionil-coenzima A,

- de una enzima E5 que cataliza la reacción de propionil-coenzima A para formar metilmalonato-semialdehído,

- de una enzima E4 que cataliza la reacción de metilmalonato-semaldehído para formar 3-hidroxiisobutirato, o

1c) la célula es capaz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3hidroxiisobutírico a través de propionil-coenzima A como producto intermedio, y 1c1) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de al menos una de las siguientes enzimas E2 a E4 y E56, E72 y E73:

- de una enzima E72 que cataliza la reacción de beta-alanina para formar betaalanil-coenzima A,

- de una enzima E73 que cataliza la reacción de beta-alanil-coenzima A para formar acrilil-coenzima A,

- de una enzima E56 que cataliza la reacción de acrilil-coenzima A para formar metilmalonil-coenzima A,

- de una enzima E2 que cataliza la reacción de metilmalonil-coenzima A para formar metilmalonato,

- de una enzima E3 que cataliza la reacción de metilmalonato para formar metilmalonato-semialdehído,

- de una enzima E4 que cataliza la reacción de metilmalonato-semialdehído para formar ácido 3-hidroxiisobutírico, o

2) la formación de ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3-hidroxiisobutírico tiene lugar a través de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A en calidad de producto previo, y en el que 2a) la célula es capaz de formar ácido 3-hidroxiisobutírico o polihidroxialcanoatos basados en ácido 3

hidroxiisobutírico a través de isobutiril-coenzima A como producto intermedio, y en el que 2a1) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de al menos una de las siguientes enzimas E76 a E79, E60, E61 y E8:

-de una enzima E76 que cataliza la reacción de piruvato para formar 2acetolactato,

-de una enzima E77 que cataliza la reacción de 2-acetolactato para formar 2, 3dihidroxiisovalerato,

-de una enzima E78 que cataliza la reacción de 2, 3-dihidroxiisovalerato para formar 2-oxoisovalerato,

-de una enzima E79 que cataliza la reacción de 2-oxoisovalerato para formar isobutiril-coenzima A,

-de una enzima E60 que cataliza la reacción de isobutiril-coenzima A para formar metacrilil-coenzima A,

-de una enzima E61 que cataliza la reacción de metacrilil-coenzima A para formar 3-hidroxiisobutiril-coenzima A,

-de una enzima E8 que cataliza la reacción de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A para formar 3-hidroxi-isobutirato, o

2a2) la célula presenta una actividad, incrementada en comparación con su tipo salvaje, de al menos una de las siguientes enzimas E8 E60 a E61 y E79 a E80:

- de una enzima E80 que cataliza la reacción de L-valina para formar 2ºxoisovalerato,

- de una enzima E79 que cataliza la reacción de 2-oxoisovalerato para formar isobutiril-coenzima A,

- de una enzima E60 que cataliza la reacción de isobutiril-coenzima A para formar

metacrilil-coenzima A,

- de una enzima E61 que cataliza la reacción de metacrilil-coenzima A para formar 3-hidroxiisobutiril-coenzima A,

- de una enzima E8 que cataliza la reacción de 3-hidroxiisobutiril-coenzima A para formar 3-hidroxiisobutirato.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la enzima E1 en 1a1) es una metilmalonil-coenzima Ahidrolasa (EC 5.4.99.2) .

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en 1a1) la enzima E2 es una metilmalonil-coenzima A-hidrolasa (EC 3.2.1.17) , E3 es una aldehído-deshidrogenasa (EC 1.2.1.3) o una aldehído-oxidasa (EC 1.2.3.1) y E4 es una 3-hidroxiisobutirato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.31) o una 3-hidroxiacil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.1.1.35) .

4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en 1a3) la enzima E6 es una metilmalonil-coenzima A-epimerasa (EC 5.1.99.1) , E7 es una metilmalonil-coenzima A-descarboxilasa (EC 4.1.1.41) , E5 es una metilmalonato-semialdehído-deshidrogenasa (EC 1.2.1.27) , y E4 es una 3-hidroxiisobutirato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.31) o una 3-hidroxiacil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.1.1.35) .

5. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en 1a4) la enzima E7 es una metilmalonil-coenzima A-descarboxilasa (EC 4.1.1.41) , E5 es una metilmalonato-semialdehído-deshidrogenasa (EC 1.2.1.27) , y E4 es una 3-hidroxiisobutirato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.31) o una 3-hidroxiacil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.1.1.35) .

6. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en 1a5) la enzima E46 es una glutamato-sintasa (EC 1.4.1.13 o EC 1.4.1.14) , una glutamato-deshidrogenasa (EC 1.4.1.2, EC 1.4.1.3 o EC 1.4.1.4) o una aspartato-transaminasa (EC 2.6.1.1 o EC 2.6.1.2) y E28 es una 2-oxoglutarato-sintasa (EC 1.2.7.3) .

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en 1b1) la enzima E4 es una 3-hidroxiisobutirato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.31) o una 3-hidroxiacil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.1.1.35) , E5 es una metilmalonato-semialdehído-deshidrogenasa (EC 1.2.1.27) , E47 es una malonil-coenzima A-descarboxilasa (EC 4.1.1.9) , una malonato-coenzima A-transferasa (EC 2.8.3.3) , una metilmalonil-coenzima A-carboxitransferasa (EC 2.1.3.1) o una acetil-coenzima A-carboxilasa (EC 6.4.1.2) , E48 es una malonato-semialdehído-deshidrogenasa (EC 1.2.1.18) , E49 es una 3-hidroxipropionato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.59) , E50 es una 3-hidroxiisobutiril-coenzima A hidrolasa (EC 3.1.2.4) , E51 es una enoil-coenzima A-hidratasa (EC 4.2.1.17) y E52 es una acil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.3.99.3) .

8. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en 1c1) la enzima E72 es una coenzima A-transferasa (EC 2.8.3.1) o coenzima A-sintetasa, preferiblemente una coenzima Atransferasa, E73 es una beta-alanil-coenzima A-amonio-lisasa (EC 4.3.1.6) , E56 es una crotonil-coenzima A-descarboxilasa E2 es una metilmalonil-coenzima A-hidrolasa (EC 3.1.2.17) , E3 es una aldehído-deshidrogenasa (EC 1.2.1.3) o una aldehído-oxidasa (EC 1.2.3.1) y E4 es una 3-hidroxiisobutirato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.31) o una 3-hidroxiacil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.1.1.35) .

9. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en 2a2) la enzima E8 es una 3-hidroxiisobutiril-coenzima A-hidrolasa (EC 3.1.2.4) , E76 es una acetolactato-sintasa (EC 2.2.1.6) , E77 es una dihidroxiisovalerato-deshidrogenasa (EC 1.1.1.86) , E78 es una 2, 3-dihidroxiisovalerato-deshidratasa (EC 4.2.1.9) ,

E79 es una 2-oxoisovalerato-deshidrogenasa (EC 1.2.1.25 o EC 1.2.4.4) , E60 es una acil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.3.99.3) , una butiril-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.3.99.2) o una 2-metilacil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.3.99.12) y E61 es una enoil-coenzima A-hidratasa (EC 4.2.1.17) .

10. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en 2a2) la enzima E8 es una 3-hidroxiisobutiril-coenzima A-hidrolasa (EC 3.1.2.4) , E60 es una acil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.3.99.3) , una butiril-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.3.99.2) o una 2-metilacil-coenzima A-deshidrogenasa (EC 1.3.99.12) , E61 es una enoil-coenzima A-hidratasa (EC 4-2.1.17) , E79 es una 2-oxoisovalerato-deshidrogenasa (EC 1.2.1.25 o EC 1.2.4.4) y E80 es una aminoácido-transferasa (EC 2.6.1.42) .

11. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que la célula se puede obtener mediante un procedimiento para la preparación de una célula modificada por tecnología genética, que comprende la etapa de procedimiento del incremento de la actividad de al menos una de las enzimas mencionadas en las reivindicaciones 1 a 10 en la célula.

12. Un procedimiento para la preparación de ácido polimetacrílico o ésteres del ácido polimetacrílico, que comprende las etapas de procedimiento IIIA) preparación de ácido metacrílico mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, IIIB) polimerización en los radicales del ácido metacrílico, pudiendo esterificarse, al menos en parte, eventualmente los grupos carboxilo del ácido metacrílico o bien el grupo carboxilato del metacrilato antes o después de la polimerización en los radicales.