PROCEDIMIENTO PARA PREPARAR EXTRACTOS DE GRANADA.

Procedimiento de producción de un extracto de granada que comprende las etapas de:

a) moler y combinar la fruta entera en agua para producir una suspensión de partículas de fruta en agua; b) eliminar los sólidos de la suspensión de la etapa a) para obtener una disolución acuosa clarificada (A); c) cargar el producto obtenido de la etapa b) en una columna cromatográfica de una resina no iónica adsorbente: caracterizado porque comprende además la etapa de d) recuperar los productos retenidos en dicha columna cromatográfica mediante elución con una disolución básica acuosa que tiene un pH dentro del intervalo de 7,5 a 8,8

La presente invención se refiere a un procedimiento para preparar extractos de granada y a dichos extractos. Más particularmente, la invención se refiere a la producción de productos que contienen elagitaninos que van a usarse como fuente de elagitaninos de granada en las industrias alimentaria, médica y cosmética. Los taninos son polifenoles vegetales que incluyen dos categorías de compuestos, taninos condensados, proantocianidinas y taninos hidrolizables, 5 incluyendo galotaninos (ésteres de ácido gálico unidos a un núcleo de azúcar) y elagitaninos (éster de ácido elágico también unido a un núcleo de azúcar). Por tanto, los elagitaninos son taninos hidrolizables que incluyen punicalaginas y otros derivados de ácido elágico tales como glucósido de ácido elágico y ramnósido de ácido elágico.

Entre los elagitaninos de la granada, las punicalaginas son los principales taninos de la piel de la fruta. Los anómeros  y  de las punicalaginas están presentes principalmente en la piel de la granada y pasan al zumo primario 10 durante el prensado para la extracción del zumo. Las punicalaginas α y β tienen la siguiente fórmula:

Estudios recientes demostraron que el zumo de granada y los extractos de granada contienen varios compuestos bioactivos, particularmente polifenoles; entre estos polifenoles, los elagitaninos son de una importancia biológica extraordinaria en vista de su actividad antioxidante, antimicrobiana y eliminadora de radicales. 15

Los estudios han demostrado que el zumo de granada tiene mayores propiedades antioxidantes que cualquier otra bebida, tal como el zumo de arándanos azules, el zumo de arándanos rojos, el té verde o el vino tinto. Los anómeros α y β de las punicalaginas son los elagitaninos predominantes en el zumo de granada, y los principales responsables de las propiedades antioxidantes del zumo. No obstante, la investigación señaló que la combinación de punicalaginas α y β con otros compuestos fitoquímicos tales como el ácido elágico y sus derivados glicosilados y otros 20 elagitaninos de granada minoritarios produce un importante efecto sinérgico que potencia los beneficios para la salud del zumo.

Se ha investigado y está investigándose activamente la producción de extractos que contienen una amplia variedad de elagitaninos y compuestos fitoquímicos procedentes de la granada; un procedimiento de extracción eficaz podría ser muy rentable. 25

Ha aparecido en el mercado una reciente profusión de extractos de granada, normalizados al 40% de ácido elágico. Sin embargo, la cantidad de ácido elágico per se no es relevante, porque se encontró que cuando el ácido elágico libre se administra por vía oral, se absorbe escasamente. De hecho, numerosos estudios concluyeron que la sinergia entre los diversos compuestos fitoquímicos de la granada y no simplemente la concentración de ácido elágico, es un factor clave para evaluar los beneficios para la salud de los extractos de granada. 30

El documento US 2006/0211635 da a conocer la purificación de elagitaninos de granada a partir de la piel de la fruta, un subproducto de la industria de zumos comerciales. El procedimiento incluye las etapas de preparar, por ejemplo mediante combinación, una suspensión acuosa de piel de granada, eliminar los sólidos suspendidos de la disolución acuosa, adsorber los elagitaninos en una superficie de resina (por ejemplo, resina XAD-16) de la disolución acuosa, eluir la superficie de la resina con etanol o metanol y evaporar el disolvente. 35

De manera similar, el documento WO2005/097106 y el artículo correspondiente “Rapid large scale purification of ellagitannins from pomegranate husk, a by product of the commercial juice industry” Separation and Purification Technology, ELSEVIER SCIENCE 41, n.º 1, enero de 2005, páginas 49-55, describe la extracción de punicalaginas sólo de la piel y la purificación en una columna aspirada por vacío de resina de adsorción. Los taninos adsorbidos en la columna se recuperan mediante elución con MeOH. 40

Estos procedimientos tienen el inconveniente de requerir el uso de disolventes orgánicos, incluso tóxicos tales como metanol, y de usar sólo pieles para evitar tener muchos azúcares en la disolución extraída. Por tanto, este

procedimiento genera un extracto que carece de varios compuestos fitoquímicos importantes presentes principalmente en la fracción de zumo de granada y contiene trazas de los disolventes orgánicos usados.

El documento WO2006/127832 da a conocer un método para producir un extracto de granada a partir de subproductos de la industria de zumos. Los sólidos de la granada, el pericarpio, la membrana interna y las semillas se mezclan con una disolución acuosa y se calientan de manera óptima hasta 43-71ºC añadiendo enzimas que degradan 5 parcialmente los sólidos de la granada. Después de eso, el procedimiento continúa tal como sigue: se eliminan los sólidos insoluble restantes mediante una variedad de métodos conocidos en la técnica (por ejemplo, microfiltración) para producir el extracto que contiene compuestos fitoquímicos de granada, y se concentra el extracto líquido resultante en un evaporador a vacío, se pasteuriza y se vuelve a concentrar en el evaporador, se enfría, se combina y se normaliza. El procedimiento descrito anteriormente incluye varios tratamientos térmicos en los que el extracto se somete a 10 calentamiento (2 h a 43-71ºC y pasteurización). La pasteurización del zumo de granada produce ácido elágico libre a través de la degradación de elagitaninos más grandes, tales como punicalaginas, lo que disminuye los beneficios para la salud de beber el zumo. Estas etapas generan varios subproductos que son difíciles de eliminar y, además, el uso de sólidos de granada procedentes de la industria de zumos genera un extracto que no contiene algunos compuestos fitoquímicos presentes principalmente en la fracción de zumo de granda. Por este motivo, el documento 15 WO2006/127832 da a conocer en una de las realizaciones la combinación de extracto y zumo de granada, lo que de hecho proporciona un amplio espectro de los compuestos fitoquímicos presentes en toda la granada, pero tiene la desventaja del alto valor calórico debido a los azúcares presentes tanto en el zumo como en el extracto.

BALA et al. “Antimutagenic effect of Pomeganate (Punica granatum var. anardana) fruit extracts on direct acting and S9-dependent mutagens in Salmonella typhimurium” en J. of Plant Science Research, 8, n.º 1/4, 1992, páginas 14-20 16, trata el efecto antimutagénico de un extracto acuoso y con cloroformo de granada obtenido sumergiendo fruta prensada en cloroformo y agua. Finalmente, se evaporó el cloroformo y se sustituyó por un volumen igual de dimetilsulfóxido.

El documento US2007/031332 da a conocer el uso de varios extractos de frutas o extractos de plantas diferentes como fuente de ácido gálico para la inhibición de la angiogénesis. El ejemplo 23 de la descripción da a 25 conocer un procedimiento de extracción de fruta de granada en el que las frutas se cortan y se prensan manualmente, se extraen en agua desionizada a una razón 1/15 p/v con ebullición durante 30 min., separación del extracto líquido, concentración y liofilización del extracto bruto, reconstitución del extracto bruto con agua desionizada a una razón 1/15 p/v y purificación en resina de adsorción con elución con etanol.

Cerdà Begoña “Evaluation of the bioavailability and metabolism in the rat of punicalagin, an antioxidant 30 polyphenol from pomegranate juice” Eur. J. of Nutrition, enero de 2003, 42, 1, páginas 18-28 y en “Repeated oral administration of high doses of the pomegranate ellagitannin punicalgin to rats for 37 days is not toxic” J. of Agric. and Food, 51, 11, mayo de 2003, páginas 3493-3501 describe la extracción de punicalagina a partir de una combinación de agua y piel de granada durante 2 horas a temperatura ambiente, filtración a través de una extracción en fase sólida, cromatografía inversa en columnas C-18 y elución con alcohol (MeOH), y mediante HPLC semipreparativa con MeOH-35 ácido acético -agua (página 3495, columna de la izquierda). Este producto es punicalagina sustancialmente pura.

Mayer W et al. en “Punicalagin und punicalin zwei gerbstoffe aus den schalen del granatäpfel”, Justus Liebigs Annalen der Chemie, Verlag Chemie GmbH, Weinheim, 11/12, 1 enero de 1977, páginas 1976-1986, da a conocer el aislamiento a partir de una mezcla de taninos obtenida...

1. Procedimiento de producción de un extracto de granada que comprende las etapas de:

a) moler y combinar la fruta entera en agua para producir una suspensión de partículas de fruta en agua;

b) eliminar los sólidos de la suspensión de la etapa a) para obtener una disolución acuosa clarificada (A);

c) cargar el producto obtenido de la etapa b) en una columna cromatográfica de una resina no iónica adsorbente:

caracterizado porque comprende además la etapa de

d) recuperar los productos retenidos en dicha columna cromatográfica mediante elución con una disolución básica acuosa que tiene un pH dentro del intervalo de 7,5 a 8,8.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que dicha disolución básica acuosa es una disolución tampón.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, que comprende además la etapa de eluir dicha columna con agua tras la elución con dicha disolución básica acuosa.

4. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, que comprende además la etapa de tratar dichas frutas en agua a un pH dentro del intervalo de 0,5 a 2,0 antes de la etapa b) o la etapa c).

5. Procedimiento según la reivindicación 4, en el que dicha combinación según la etapa a) se lleva a cabo en agua a un pH dentro del intervalo de 0,5 a 2,0.

6. Procedimiento según la reivindicación 4 ó 5, que comprende además la etapa de elevar el pH de la mezcla de extracción hasta un valor dentro del intervalo de 3,5 a 5,0 antes de llevarse a cabo dicha etapa c) de purificación.

7. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que comprende además la etapa de:

e) eliminar el agua y las sales del producto líquido eluido de dicha resina.

8. Procedimiento según cualquier reivindicación anterior, que comprende además, antes de la etapa b) o la etapa c), las etapas de:

- calentar el producto a una temperatura dentro del intervalo de 70ºC a 100ºC durante un periodo de tiempo dentro del intervalo de 1 segundo a 120 segundos y posteriormente enfriar dicho producto calentado hasta una temperatura inferior a 60ºC, preferiblemente dentro del intervalo de 20ºC a 60ºC.

9. Producto líquido que contiene elagitaninos como el que puede obtenerse a través de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 8, y que tiene un contenido de punicalaginas de al menos el 5% (p/v) con una pureza de punicalaginas de al menos el 55% (mediante HPLC a 360 nm) y un contenido de ácido elágico inferior al 1,5%.

10. Producto que contiene elagitaninos como el que puede obtenerse a través de un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 1 a 8, y que tiene un contenido de punicalaginas de al menos el 30% (p/p) con una pureza de punicalaginas de al menos el 55% (mediante HPLC a 360 nm) y un contenido de antocianinas de al menos el 0,1%.

11. Producto sólido que contiene elagitaninos según la reivindicación 10, que tiene un contenido de punicalaginas de al menos el 30% (p/p) con una pureza de punicalaginas de al menos el 55% (mediante HPLC a 360 nm), un contenido de ácido elágico no superior al 5%, y un contenido de fenoles totales de al menos el 35%.

12. Producto que contiene elagitaninos caracterizado por tener un contenido de punicalina de al menos el 20% (p/p) con un contenido de punicalaginas inferior al 0,1% y un contenido de ácido elágico inferior al 0,1% como el que puede obtenerse a través de las etapas siguientes:

w) hidrólisis enzimática con tanasa de los extractos con una composición según cualquiera de las reivindicaciones anteriores 9 a 11,

x) purificación mediante adsorción sobre una resina de adsorción.

y) elución de dicha resina con agua

z) eliminación de agua mediante secado por pulverización.

13. Extractos de granada que tienen un contenido de punicalaginas de al menos el 0,5% y que comprenden como vehículo una fibra soluble que tiene un contenido de beta-glucano (base seca) de al menos el 30%.

14. Extractos de granada que tienen un contenido de punicalina de al menos el 0,5% y que comprenden como vehículo una fibra soluble que tiene un contenido de beta-glucano (base seca) de al menos el 30%.

15. Extractos de granadas que comprenden como vehículo una fibra soluble que tiene un contenido de beta-glucano (base seca) de al menos el 30%.

16. Extractos de granada según las reivindicaciones 13 a 15, en los que dicha fibra soluble se selecciona entre fibra soluble rica en beta-glucano de avena, fibra soluble rica en beta-glucano de cebada o su mezcla.

17. Pasta que contiene sólido de granada como la que puede obtenerse según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, tras separar los sólidos de la disolución acuosa de la mezcla de extracción de la etapa a) según la etapa b) de la reivindicación 1.

18. Pasta que contiene sólido de granada según la reivindicación 17, que tiene un contenido de humedad inferior al 15% y una actividad de eliminación de radicales libres ABTS de 50 a 2500 (equivalente de Trolox micromolar).

19. Uso de la pasta de granada según las reivindicaciones 17 ó 18, como producto alimenticio o como pronutriente en pienso para animales.

20. Planta para producir un extracto de granada, que comprende medios de extracción de dichos elagitaninos de la fruta, caracterizado porque comprende medios de combinación de granada para proporcionar una mezcla de extracción de sólidos suspendidos en agua, una fuente de agua, una fuente de ácido para preparar agua acidificada a un pH dentro del intervalo de 0,5 a 1,5, medios para tratar el extracto crudo de granada para obtener una disolución acuosa clarificada, al menos una columna cromatográfica de una resina seleccionada de una resina no iónica adsorbente que es un polímero aromático entrecruzado macrorreticular y medios para alimentar a dicha al menos una columna una disolución básica acuosa con un pH dentro del intervalo de 7,8 a 8,8 para recuperar los productos retenidos en dicha columna cromatográfica.

21. Planta según la reivindicación 20, que comprende además medios para la eliminación de sales y agua de dicha disolución acuosa eluida de dicha columna y medios de tratamiento térmico de dicho extracto crudo de granada o dicha disolución acuosa clarificada para la inactivación de enzimas, es decir, tanasa libre, y/o microorganismo, es decir, microorganismos formadores de tanasa.