Procedimiento para el aislamiento de haptoglobina.
Un procedimiento para el aislamiento de haptoglobina humana (Hp) de la fracción V de Cohn humana,
en el que dicho procedimiento comprende:
a) cargar dicha fracción V de Cohn humana en un sustrato de intercambio aniónico, y
b) eluir de forma selectiva la Hp humana del mismo.
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2005/004037.
Solicitante: Bio Products Laboratory Limited.
Nacionalidad solicitante: Reino Unido.
Dirección: Dagger Lane Elstree Hertfordshire WD6 3BX REINO UNIDO.
Inventor/es: DALTON,Joan, PODMORE,Adrian, KUMPALUME,Peter.
Fecha de Publicación: .
Clasificación Internacional de Patentes:
- C07K14/47 QUIMICA; METALURGIA. › C07 QUIMICA ORGANICA. › C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › de mamíferos.
PDF original: ES-2379157_T3.pdf
Fragmento de la descripción:
Procedimiento para el aislamiento de haptoglobina.
La haptoglobina (Hp) es una proteína de respuesta de fase aguda que se sintetiza principalmente en el hígado. También se sintetiza en otros tejidos, tales como las paredes arteriales, el endometrio y el peritoneo.
La función principal de la Hp es como proteína de unión de la hemoglobina (Hb), necesaria para el procesamiento terminal y eliminación de la Hb libre, principalmente en el sistema retículo endotelial (SER) del hígado. Este sistema permite conservar el hierro presente en el resto Hb.
La molécula hemo (ferroprotoprofirina IX) encontrada en la Hb es un elemento indispensable en una amplia variedad de otros sistemas proteicos (p. ej., enzimas, tales como ciclooxigenasa [COX] y óxido nítrico sintasa [NOS]), que actúan de acuerdo con las propiedades del(los) polipéptidos unidos a ella. No obstante, un exceso de hemo libre puede producir daños celulares y lesiones tisulares (p. ej., en riñones, pulmones y SNC), ya que cataliza la formación de especies de oxígeno reactivo, que, a su vez, producen estrés oxidativo.
La hemólisis intravascular se produce fisiológicamente, pero también acelera como complicación grave en varias enfermedades autoinmunitarias, infecciosas (p. ej., paludismo) y hereditarias (p. ej., drepanocitosis). Durante la hemólisis, la Hb vascular libre es captada por la Hp y transportada al SER hepático. Asimismo, puede tener lugar algún procesamiento en los monocitos-macrófagos. No obstante, la Hb vascular libre se puede convertir rápidamente en met-Hb, que libera fácilmente el resto hemo potencialmente tóxico. El hemo vascular libre es capturado por la albúmina o la hemopexina (Hx) y es transportado al hígado para la degradación en el SRE. Cuando se acumulan grandes cantidades de hemo (p. ej., en un coágulo de sangre o depósito vascular), los mecanismos secuestrantes se ven superados o incapaces de acceder al hemo libre y se producen daños tisulares. Si la cantidad de lisis de glóbulos rojos satura el sistema de eliminación de hemo/Hb, la Hb comenzará a aparecer en la orina (filtración glomerular en el riñón).
La Hp tiene una estructura tetramérica que comprende dos cadenas α y dos β unidas por puentes disulfuix). La cadena β (245 aminoácidos) tiene una masa de aproximadamente 40 kDa (del cual 30% p/p en hidrato de carbono) y comparte todos los fenotipos. La cadena a existe en dos formas: αα1, (83 aminoácidos, 9 kDa) y α2 (142 aminoácidos, 17,3 kDa) y, por tanto, la Hp se produce en tres fenotipos, denominados Hp1-1, Hp2-1 y Hp2-2. La Hp1-1 contiene dos cadenas α1, la Hp2-2 contiene dos cadenas α2 y la Hp2-1 contiene una cadena α1 y una α2. La HP1-1 tiene una masa molecular de 100 kDa o 165 kDa cuando forma complejo con la Hb. La Hp1-1 existe en forma de una única isoforma y también se denomina dímero Hp. La H?2-1 tiene una masa molecular medía de 220 kDa y forma polímeros lineales. La Hp2-2 tiene una masa molecular media de 400 kDa y forma polímeros cíclicos. Cada forma polimérica diferente es una isoforma diferente. Se ha concebido una metodología de PCR (Koch y col. 2002, Clin. Chem 48:1377-1382) para estudiar el polimorfismo de Hp.
La Hp se ha identificado como posible tratamiento para trastornos renales causados por hemólisis. Es potencialmente útil terapéuticamente como medio de eliminar la hemoglobina libre; los complejos formados de este modo tienen posibles beneficios adicionales como agentes antiinflamatorios, antioxidantes o angiogénicos. No obstante, la Hp se considera difícil de aislar en grandes cantidades y conservar su actividad biológica. Se han descrito diversos protocolos para aislar la Hp. Uno habitual es la cromatografía de afinidad. Los ligandos de afinidad usados incluyen anticuerpos monoclonales (Katnik y Jadach, 1993, Arch. Immunol. Ther. Exp. (Warz) Vol. 41: 303-308 y Tseng y col., 2004, Protein Expr Purif 33: 265-273), hemoglobina (Liau y col., 2003, J Chromatogr. Analyt, Technol Bromed Life Sci. 790: 209-216 y Chiancone y col. 1995, J Chromatogr. Biomed Appl. 664: 89-95) y concanavalina A (Katnik y col. 1995, Eur J Clin. Chem. Clin. Biochem 33:727-732).
Aunque los protocolos de ligando de afinidad basados en anticuerpos monoclonales tienen como resultado un producto razonablemente puro, solo se han comunicado rendimientos bajos. Dichos procedimientos de aislamiento tampoco son muy adecuados para los procedimientos de producción a gran escala como resultado de la necesidad de grandes cantidades de ligando de afinidad. En particular, es probable que las cantidades necesarias de anticuerpos monoclonales sean prohibitivamente caros y difíciles de obtener. Los anticuerpos monoclonales también tienen el posible inconveniente de ser selectivo para varias isotermas de Hp. El uso de Hb como el ligando de afinidad ha conseguido más éxito. Se han conseguido buenos rendimientos de Hp razonablemente homogénea, aunque, como ocurre con todos los protocolos basados en ligandos de afinidad, escalar el procedimiento es difícil y a menudo no es rentable. Otro inconveniente de los protocolos basados en ligandos de afinidad es que si el producto de Hp está destinado a su uso como agente farmacéutico, la fuente del ligando de afinidad debe controlarse. A este respecto, la Hb puede no ser aceptable para los reguladores, ya que su fuente son los glóbulos rojos. También es necesario monitorizar y controlar la pérdida de ligando, ya que la presencia del ligando de afinidad en el producto puede plantear problemas para su uso seguro en pacientes.
También se ha descrito la precipitación selectiva de Hp por un extracto de raíz vegetal (Nayak, y col., 2002, Pro. Pep. Lett 9: 503-510). No obstante, como la cromatografía de afinidad, este protocolo tampoco es adecuado para la producción comercial a gran escala.
Asimismo se han realizado técnicas basadas en HPLC (cromatografía de líquidos de alto rendimiento) sobre un precipitado de sulfato amónico de suero porcino (Yang y Mao, 1999, J. Chromatogr. B. Biomed. Sci. Appl., 731: 395-402). De nuevo, este protocolo sólo se considera adecuado para el aislamiento a pequeña escala de la Hp.
Un enfoque alternativo al aislamiento de la Hp ha sido la cromatografía de intercambio iónico. Los documentos US 4,061,735 y US 4,137,307 han descrito el aislamiento de la Hp a través de cromatografía de intercambio aniónico de precipitados de sulfato amónico de plasma humano o fracciones Cohn IV, IV-1 o IV-4 derivadas de plasma humano. Se ha indicado que la precipitación en sulfato amónico elimina la transferrina, la albúmina y otras proteínas no deseables. Para este procedimiento es esencial que el sustrato del intercambio iónico es un sustrato del intercambio aniónico fuerte, tal como QAE-Sephadex® o GE celulosa. Este procedimiento no es adecuado para el aislamiento comercial a gran escala de Hp por las enormes cantidades de sal (sulfato amónico) contaminada que tendrían que eliminarse. Los procedimientos discontinuos de purificación usando un intercambiador aniónico tampoco son ideales para el escalado.
Se ha dado a conocer el aislamiento de HP del plasma de conejo precipitado en acetato sódico-ácido acético usando el sustrato de intercambio aniónico DE-52 celulosa microgranular (DEAE celulosa) (Basler y Burrel, 1983 Inflammation 7(4): 387-400). Fue necesario el Enfoque Isoeléctrico Preparativo para conseguir un grado razonable de pureza del producto. No obstante, aunque se indicó un rendimiento máximo de entre 50 y 70%, el análisis de los datos indica que el rendimiento fue, de hecho, 44% y la purificación sólo se triplicó. Este protocolo no es adecuado para usara escala comercial grande debido a su complejidad.
El documento JP2004-244348 divulga el aislamiento de Hp de la fracción humana IV usando cromatografía de intercambio aniónico.
Akaiwa y col. 1982, Anal. Biochem. Vol. 123(1): 178-182 divulga el aislamiento de Hp de suero de rata.
El documento US 2003/158391 divulga el aislamiento de Hp de componentes sanguíneos, tales como suero o plasma, mediante precipitación en sulfato amónico, purificación por cromatografía de afinidad o filtración en gel.
Es un objetivo de la presente invención mejorar que actualmente está disponible para el aislamiento de Hp en uno o más de los aspectos siguientes: rendimiento y/o pureza de Hp y reproducibilidad de los mismos, simplicidad del procedimiento e idoneidad para usar a una escala grande y/o comercial en términos de viabilidad económica.
Ahora se ha descubierto... [Seguir leyendo]
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento para el aislamiento de haptoglobina humana (Hp) de la fracción V de Cohn humana, en el que dicho procedimiento comprende:
2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que todas las isoformas de Hp humana presentes en la fracción V de Cohn humana se aíslan de la fracción V de Cohn humana.
3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o la reivindicación 2, en el que dicho procedimiento comprende cromatografía de intercambio aniónico de dicha fracción V de Cohn humana usando un sustrato de intercambio aniónico débil.
4. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, en el que dicho sustrato de intercambio aniónico débil es DEAE agarosa.
5. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dicho procedimiento comprende:
6. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que las etapas de carga y de lavado usan tampones de conductividad de entre 0,1 y 3,0 mS/cm.
7. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 6, en el que las etapas de carga y de lavado usan tampones de conductividad de entre 1,0 y 2,0 mS/cm.
8. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que las etapas de carga y de lavado usan tampones de pH entre 3 y 7.
9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8, en el que las etapas de carga y de lavado usan tampones de conductividad de entre 4,2 y 5,0.
10. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la etapa de elución usa tampones de conductividad de entre 8,0 y 15,0 mS/cm.
11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que la etapa de elución usa tampones de conductividad de entre 10,5 y 12,5 mS/cm.
12. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, en el que la etapa de elución usa tampones de pH entre 4 y 6.
13. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 12, en el que la etapa de elución usa tampones de pH de entre 4,2 y 5,0.
14. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 13, en el que los tampones de carga y/o de lavado y/o de elución comprenden acetato sódico, ácido acético y cloruro sódico.
15. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14, en el que dicho procedimiento comprende:
16. Un procedimiento para el aislamiento de isoformas de Hp humana individuales de la fracción V de Cohn humana, en el que dicho procedimiento comprende cromatografía de intercambio aniónico de dicha fracción V de Cohn humana.
17. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 16, en el que el eluato se monitoriza para identificar la elusión de isoformas de Hp humana discretas.
18. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 17, en el que la isoforma Hp1-1 humana se conserva en el producto final.
19. Un procedimiento para el aislamiento de albúmina y haptoglobina humana de la fracción V de Cohn, en el que dicho procedimiento comprende:
20. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 19, en al que dicho procedimiento comprende además al menos una etapa de concentración y/o purificación.
21. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la al menos una etapa de concentración y/o purificación se selecciona de diafiltración, ultrafiltración, cromatografía de flujo pasante, cromatografía de quelatos metálicos y cromatografía con hidroxiapatita.
22. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 20, en el que la al menos una etapa de purificación es cromatografía de interacción hidrofóbica.
23. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 22, en el que dicho procedimiento comprende además al menos una etapa de eliminación de contaminante.
24. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 23, en el que dicha etapa de eliminación de contaminante es una etapa de inactivación o eliminación de virus.
25. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 24, en el que dicha etapa de inactivación o eliminación de virus comprende tratamiento con detergente disolvente y/o filtración de virus.
26. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 25, que comprende:
en el que la etapa (b) y la etapa (c) pueden tener lugar en cualquier orden.
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