Un procedimiento para detectar ácidos nucleicos, que tiene las operaciones siguientes:

- proporcionar al menos una nanopartícula que está funcionalizada por medio de al menos un oligonucleótido que está unido a ella y que es capaz de hibridarse con al menos un segmento de un ácido nucleico que se va a detectar;

- poner la nanopartícula funcionalizada en contacto con una muestra en que se va a detectar el ácido nucleico, estando el ácido nucleico que se va a detectar y la nanopartícula disueltos o suspendidos en un medio acuoso; y

- medir una propiedad que proporciona información acerca del grado de hibridación del al menos un oligo- nucleótido con el ácido nucleico que se va a detectar, caracterizado por que las nanopartículas tienen un diámetro de entre 5 nm y 80 nm;

y el procedimiento se desarrolla por medio de al menos las operaciones siguientes:

a) medir la propiedad que proporciona información acerca del grado de hibridación del ácido nucleico con el oligonucleótido a una temperatura inicial predeterminada;

b) excitar la nanopartícula para generar calor; y

c) medir de nuevo la propiedad que proporciona información acerca del grado de hibridación del ácido nucleco con el oligonucleótido, y comparar los resultados de las mediciones antes y después de la excitación de las nanopartículas para generar calor, con objeto de determinar una señal de fusión que sea una medida del cambio en el grado de hibridación en virtud del calentamiento local sin que se caliente la muestra entera.

Procedimiento para detectar ácidos nucleicos

Antecedentes del invento

El presente invento se refiere a un procedimiento para detectar ácidos nucleicos, de acuerdo con la porción de precaracterización de la Reivindicación 1.

Nivel actual de desarrollo técnico

Muchos procedimientos para detectar ácidos nucleicos se basan en la técnica del análisis de curvas de fusión. Con esta técnica se explota el efecto de que las cadenas de ácido nucleico de doble hebra se pueden deshibridar en cadenas de hebra sencilla en el caso de un aumento de temperatura, un proceso que se describe en este contexto como "fusión". La temperatura de fusión depende, inter alia, del grado de complementariedad de los dos compañeros de hibridación.

A partir de la solicitud publicada de EE.UU. US 2004/0219520 A1 y del artículo de C. Mirkin et al. titulado "One-Pot Colorimetric Differentiation of Polynucleotides with Single Base Imperfections Using Gold Nanoparticle Probes", J. Am. Chem. Soc., 1998, volumen 120, páginas 1959-1964, se conoce un procedimiento para detectar ácidos nucleicos en que se utilizan nanopartículas de oro que están funcionalizadas con oligonucleótidos. Los ácidos nucleicos que se van a detectar y las nanopartículas de oro funcionalizadas son disueltos o suspendidos en un medio acuoso para muestras. Una fracción de los oligonucleótidos tiene una secuencia de bases que es capaz de hibridarse con un primer segmento de las moléculas de ácido nucleico que se van a detectar, y otra fracción de los oligonucleótidos tiene una secuencia de bases que es capaz de hibridarse con un segundo segmento de las moléculas de ácido nucleico que se van a detectar. En virtud de la hibridación, las nanopartículas de los ácidos nucleicos se conectan con objeto de formar grandes agregados, lo que da lugar a un ensanchamiento y un desplazamiento hacia el rojo de su resonancia de plasmones de partícula. Lo último puede ser determinado mediante mediciones de extinción lumínica. Ahora, si se aumenta gradualmente la temperatura de la muestra, se produce una deshibridación y, como consecuencia, una disolución de los agregados, a una temperatura de fusión que es característica del ácido nucleico que se va a detectar. Con una curva de fusión que indica la extinción lumínica en función de la temperatura, esto puede ser observado como una abrupta transición. Mirkin et al. comunican que fueron capaces de distinguir curvas de fusión de ácidos nucleicos, cuyos segmentos eran completamente complementarios de las secuencias de bases de los oligonucleótidos de las nanopartículas funcionalizadas, de aquellos ácidos nucleicos que diferían en una base. También se comunica que ha sido posible detectar ácidos nucleicos totalmente complementarios en una mezcla de ácidos nucleicos totalmente complementarios que difieren en una base.

En el procedimiento conocido, puede resultar desventajoso que la determinación de la curva de fusión lleve un tiempo considerable, típicamente de 30 minutos a 120 minutos, porque, después de cada paso de temperatura, se ha de observar una espera hasta que se hayan alcanzado una temperatura uniforme y un equilibrio entre ácidos nucleicos hibridados y deshibridados en la muestra. Además, el procedimiento conocido puede causar dificultades a la hora de detectar ácidos nucleicos que difieren en una base en una mezcla de ácidos nucleicos totalmente complementarios que difieren en una base.

Además, a partir del artículo de A. O. Govorov et al. titulado "Generating heat with metal nanoparticles", Nano Today, 2007, volumen 2, nº 1, páginas 30-38, se sabe que se pueden excitar nanopartículas de oro y nanopartículas de plata para generar calor irradiándolas con luz. En este artículo, también se comunica que, en el caso de una excitación idéntica, el calor generado por dos partículas de oro adyacentes es mayor que el calor generado por dos partículas individuales. Este efecto cooperativo se atribuye a una interacción de Coulomb entre las nanopartículas adyacentes.

En el artículo de J. L. West et al. titulado "Nanoshell-mediated near-infrared termal therapy of tumours under magnetic resonance guidance", PNAS, 2003, volumen 100, nº 23, páginas 13.549-13.554, se conocen nanopartículas, consistentes en partículas de sílice rodeadas por una cubierta de oro ("nanocubiertas") , que generan calor, particularmente bajo una irradiación con luz infrarroja. Los autores proponen emplear las nanopartículas para la disolución térmica de tumores.

Jacobson et al., en "Remote electronic control of DNA hybridization through inductive coupling to an attached metal nanocr y stal antenna", Nature, 2002, volumen 415, páginas 152-155, describen una nanopartícula de oro que está covalentemente enlazada con un segmento de ácido nucleico en forma de bucle que conecta los extremos autocomplementarios de una molécula de DNA en forma de horquilla con otra. La nanopartícula de oro es excitada para generar calor por medio de un acoplamiento inductivo a un campo magnético de radiofrecuencia, con objeto de aumentar la temperatura local de la molécula de DNA que está unida a la nanopartícula y, de este modo, inducir una deshibridación de los extremos autocomplementarios. En el mismo artículo, Jacobson et al. describen también un procedimiento en el que oligonucleótidos están unidos a una nanopartícula de oro por uno de sus extremos y portan un fluoróforo en su otro extremo. Los oligonucleótidos complementarios de los mismos están unidos a un glóbulo de agarosa revestido con estreptavidina. Los dos oligonucleótidos complementarios se hibridan. Posteriormente se provoca una deshibridación, específicamente mediante un aumento local de la temperatura por medio de la excitación de las nanopartículas de oro en un campo magnético de radiofrecuencia, o mediante un aumento de la temperatura de la muestra. En cada caso, se determina el grado de hibridación basándose en la fluorescencia del sobrenadante.

Problema subyacente al invento

El problema que subyace al invento es proporcionar un procedimiento mejorado para detectar ácidos nucleicos.

Solución de acuerdo con el invento

Con el fin de alcanzar el objetivo, el invento enseña un procedimiento para detectar ácidos nucleicos, procedimiento que tiene las características de la Reivindicación 1.

En el sentido del presente invento, las nanopartículas son partículas que, en virtud de su tamaño, presentan unas propiedades ópticas especiales, en particular unos espectros de absorción o espectros de dispersión característicos que no aparecen, o no aparecen tan claramente, en el material masivo. Las nanopartículas metálicas descritas por

A. O. Govorov et al., anteriormente referidas, y las descritas por J. M. Jacobson et al., anteriormente referidas, se nombran meramente a modo de ejemplo. Las nanopartículas tienen un diámetro de entre 5 nm y 80 nm.

Las nanopartículas pueden ser globulares pero, en particular, también se tienen en consideración las formas no globulares, por ejemplo, las nanopartículas de tipo varilla. Se conocen procedimientos para producir y funcionalizar las nanopartículas a partir de, por ejemplo, el artículo de Mirkin et al.

En relación con el presente invento, el término "oligonucleótido" abarca preferiblemente no sólo desoxioligorribonucleótidos sino también oligonucleótidos que contienen uno o más compuestos nucleotídicos análogos con modificaciones en su cadena principal [por ejemplo, metilfosfonatos, fosfotioatos o ácidos nucleicos peptídicos (PNA; del inglés, peptide nucleic acids) ], en particular en un azúcar de la cadena principal [por ejemplo, derivados 2'-Oalquílicos, 3'- y/o 5-aminorribosas, ácidos nucleicos bloqueados (LNA; del inglés, locked nucleic acids) , ácidos nucleicos de hexitol o triciclo-DNA; a este respecto, véase el artículo de D. Renneberg y C. J. Leumann titulado "Watson-Crick base-pairing properties of tricyclo-DNA", J. Am. Chem. Soc., 2002, volumen 124, páginas 5993-6002], o contienen los compuestos de base análogos, por ejemplo, 7-desazapurina, o bases universales tales como nitroindol, o bases naturales modificadas tales como N4-etilcitosina. En una realización del invento, los oligonucleótidos son productos de conjugación o quimeras con compuestos análogos no nucleosídicos, por ejemplo, PNAs. En una realización del invento, los oligonucleótidos contienen, en una o más posiciones, unidades no nucleosídicas tales como espaciadores, por ejemplo, hexaetilenglicol o espaciadores... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para detectar ácidos nucleicos, que tiene las operaciones siguientes:

– proporcionar al menos una nanopartícula que está funcionalizada por medio de al menos un oligonucleótido que está unido a ella y que es capaz de hibridarse con al menos un segmento de un ácido nucleico que se va a detectar;

– poner la nanopartícula funcionalizada en contacto con una muestra en que se va a detectar el ácido nucleico, estando el ácido nucleico que se va a detectar y la nanopartícula disueltos o suspendidos en un medio acuoso; y

– medir una propiedad que proporciona información acerca del grado de hibridación del al menos un oligonucleótido con el ácido nucleico que se va a detectar,

caracterizado por que

las nanopartículas tienen un diámetro de entre 5 nm y 80 nm; y

el procedimiento se desarrolla por medio de al menos las operaciones siguientes:

a) medir la propiedad que proporciona información acerca del grado de hibridación del ácido nucleico con el oligonucleótido a una temperatura inicial predeterminada;

b) excitar la nanopartícula para generar calor; y

c) medir de nuevo la propiedad que proporciona información acerca del grado de hibridación del ácido nucleico con el oligonucleótido, y comparar los resultados de las mediciones antes y después de la excitación de las nanopartículas para generar calor, con objeto de determinar una señal de fusión que sea una medida del cambio en el grado de hibridación en virtud del calentamiento local sin que se caliente la muestra entera.

2. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1,

caracterizado por que

se aplica radiación electromagnética para excitar la nanopartícula para generar calor.

3. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1 ó 2,

caracterizado por que

la nanopartícula incluye un metal noble.

4. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado por que

la propiedad es una propiedad óptica de la nanopartícula.

5. Un procedimiento de acuerdo con una de las Reivindicaciones 1 a 3, caracterizado por que, en el curso del proceso, se proporciona además al menos un marcador coloreado, y la propiedad es una pro

piedad óptica del marcador coloreado.

6. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado por que

el ácido nucleico que se va a detectar comprende al menos dos segmentos, y se proporcionan al menos dos nanopartículas, estando al menos una de las nanopartículas funcionalizada con un oligonucleótido que es capaz de hibridarse con el primer segmento del ácido nucleico, y estando al menos una de las nanopartículas funcionalizada con un oligonucleótido que es capaz de hibridarse con el segundo segmento del ácido nucleico.

7. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 1,

caracterizado por que

se llevan a cabo las operaciones a) a c) al menos una primera vez y una segunda vez, siendo excitada la nanopartícula de un modo variablemente intenso para generar calor en el curso de las pasadas.

8. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 7,

caracterizado por que,

en el curso de cada pasada, se determina una señal de fusión a partir de una comparación de la propiedad antes y después de la excitación de la nanopartícula, y se determina un umbral de fusión a partir de la comparación de las señales de fusión.

9. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 8,

caracterizado por que

el ácido nucleico se detecta basándose en un umbral de fusión que es específico del ácido nucleico a una temperatura inicial dada.

10. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 8,

caracterizado por que

se determina el umbral de fusión para varias temperaturas iniciales con objeto de determinar una curva de umbrales de fusión.

11. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 10,

caracterizado por que

se determina el gradiente de la curva de umbrales de fusión.

12. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 10

caracterizado por que

se extrapola linealmente la curva de umbrales de fusión hasta un punto cero del umbral de fusión.

13. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado por que

el primer ácido nucleico se detecta basándose en una temperatura de apareamiento que es específica del ácido nucleico.

14. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 13,

caracterizado por que el ácido nucleico se detecta en virtud del hecho de que un umbral de fusión se encuentra por debajo de un cierto valor a una temperatura inicial que es sustancialmente mayor o igual que la temperatura de apareamiento.

15. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 13 ó 14,

caracterizado por que

se desarrolla a través de al menos las operaciones siguientes:

– determinar al menos un umbral de fusión a al menos una temperatura inicial por debajo de la temperatura de apareamiento;

– elevar temporalmente la temperatura inicial hasta la temperatura de apareamiento o por encima de ella;

– determinar al menos un umbral de fusión a al menos una temperatura inicial por debajo de la temperatura de apareamiento; y

– comparar los umbrales de fusión determinados antes y después de la elevación temporal de la temperatu5 ra inicial por encima de la temperatura de apareamiento.

16. Un procedimiento de acuerdo con la Reivindicación 6 ó 7,

caracterizado por que

se llevan a cabo las operaciones a) a c) al menos una primera vez y una segunda vez, siendo variable en el curso de las pasadas la temperatura inicial predeterminada, se determina con cada pasada una señal de fusión a partir de una comparación de la propiedad antes y después de la excitación de la nanopartícula, y se comparan las señales de fusión de las pasadas.

17. Un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes,

caracterizado por que

se proporcionan varias fracciones de nanopartículas que tienen diferentes propiedades de excitación, se funcionalizan las nanopartículas de una primera fracción para un primer ácido nucleico que se va a detectar, y se funcionalizan las nanopartículas de una segunda fracción para un segundo ácido nucleico que se va a detectar, que es diferente del primer ácido nucleico.