PROCEDIMIENTO DE OBTENCION DE L-DOPA A PARTIR DE L-TIROSINA UTILIZANDO LA ENZIMA TIROSINASA NP 518458 DE LA BACTERIA RALSTONIA SOLANACEARUM.

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir 3,

4-dihidroxi-L-fenilalanina (a partir de ahora L-dopa) a partir de L-tirosina, utilizando como catalizador una enzima tirosinasa obtenida a partir de un microorganismo, concretamente la tirosinasa NP_518458 obtenida de la bacteria Ralstonia solanacearum. El procedimiento propuesto por la presente invención, permite la acumulación de todo el L-dopa formado, evitando la desventaja de la oxidación no deseada del L-dopa que se va formando y, por tanto, la pérdida de producto que se produce con el uso de otras tirosinasas descritas en el Estado de la Técnica

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P200600663.

Solicitante: UNIVERSIDAD DE MURCIA.

Nacionalidad solicitante: España.

Provincia: MURCIA.

Inventor/es: SANCHEZ AMAT,ANTONIO, SOLANO MUOZ,FRANCISCO, HERNANDEZ ROMERO,DIANA.

Fecha de Solicitud: 15 de Marzo de 2006.

Fecha de Publicación: .

Fecha de Concesión: 22 de Febrero de 2010.

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N9/02H3B1
  • C12P13/22D
  • C12R1/05 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12R SISTEMA DE INDEXACION ASOCIADO A LAS SUBCLASES C12C - C12Q, RELATIVO A LOS MICROORGANISMOS.C12R 1/00 Microorganismos. › Alcaligenes.

Clasificación PCT:

  • C12N9/02 C12 […] › C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Oxidorreductasas (1.), p. ej. luciferasa.
  • C12P13/22 C12 […] › C12P PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN ENZIMAS PARA LA SINTESIS DE UN COMPUESTO QUIMICO DADO O DE UNA COMPOSICION DADA, O PARA LA SEPARACION DE ISOMEROS OPTICOS A PARTIR DE UNA MEZCLA RACEMICA.C12P 13/00 Preparación de compuestos orgánicos que contienen nitrógeno. › Triptófano; Tirosina; Fenilalanina; 3,4-Dihidroxifenilalanina.
  • C12R1/05 C12R 1/00 […] › Alcaligenes.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento de obtención de L-dopa a partir de L-tirosina utilizando la enzima tirosinasa NP_518458 de la bacteria Ralstonia solanacearum.

Sector de la técnica

La presente invención se refiere a un procedimiento para producir 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (a partir de ahora L-dopa) a partir de L-tirosina, utilizando como catalizador una enzima tirosinasa obtenida a partir de un microorganismo, concretamente la tirosinasa NP_518458 obtenida de la bacteria Ralstonia solanacearum.

Estado de la técnica

La 3,4-dihidroxi-L-fenilalanina (a partir de ahora L-dopa) se utiliza para el tratamiento de la enfermedad de Parkinson. Se sabe que el L-dopa está presente en la cáscara y en las semillas de la planta Vicia faba, haba de donde se puede obtener por extracción. El L-dopa se puede obtener por síntesis a partir de productos intermedios como la vainillina y la tirosina.

El L-dopa también se produce bioquímicamente utilizando L-tirosina y tirosinasa, o con otros sustratos y ß-tirosinasa producida por un microorganismo como se describe después. La L-tirosina es uno de los aminoácidos esenciales y se produce a escala comercial por extracción de sustancias naturales y enzimáticamente.

Katsuji Haneda, Shiro Watanabe, y Isao Takeda son los autores de "Synthesis of L-3,4-Dihydroxyphenylalanine from L-Tyrosine by Microorganisms" publicado en Applied Microbiology, 22, 721-722 (1971) en el que describen que L-dopa puede ser sintetizada eficientemente a partir de L-tirosina en condiciones ácidas (pH de 2 a 5) a partir de especies de hongos Aspergillus, concretamente la A. chevalier y la A. oryzae sin necesidad de cofactores, mientras que a un pH neutro o alcalino, la L-tirosina se descompone en otros metabolitos y el L-dopa no se acumula.

En la patente GB 1268721 (Ajinomoto Co., Inc.), publicada el 29 de marzo de 1972, se describe un proceso para producir L-dopa o sus derivados, que comprende la reacción de catecol y uno o más aminoácidos seleccionados entre cisteína, S-alquilp-cisteína (donde alquilp- significa un grupo alquilo pequeño, con uno o dos átomos de carbono, normalmente metil o etil), cistina, serina y alanina, y/o una sal de dichos aminoácidos, en un medio acuoso en presencia de ß-tirosinasa como catalizador; dicha beta-tirosinasa se produjo por cultivo de uno de los microorganismos seleccionado entre los género siguientes: Escherichia, Aerobacter, Erwinia, Citrobacter, Pseudomonas, Bacillus, Xanthomonas y Proteus. Los mismos autores, en la patente US 3791924 (Ajinomoto Co., Inc.), publicada el 12 de febrero de 1974, describen un método para la obtención de L-dopa por medio de la acción de una ß-tirosinasa producida por el cultivo de microorganismos seleccionados entre los género Citrobacter, Proteus, Pseudomonas, Aerobacter, Salmonella, Erwinia, Paracolobactrum o Alcaligenes, con un compuesto que puede ser: catecol, fenol y resorcina, con a) uno o más aminoácidos seleccionados entre cisteína, S-alquilp-cisteina (grupo alquilo pequeño), cistina, serina y alanina, o con b) amonio y un segundo compuesto del grupo que consiste en ácido pirúvico, oxalacético, malico, fumarico, glioxílico y láctico, en un medio acuoso a un pH entre 4 y 11.

En las patentes EP 0618299 Al y EP 0636695 Al (ambas solicitadas por Ajinomoto Co., Inc) publicadas respectivamente el 01.04.1993 y 21.07.1994, se describen métodos para la producción de L-dopa a partir de catecol, ácido piruvico y iones amonio, o catecol y L-serina, en presencia de 13-tirosinasa producida por Erwinia herbicola. El método de la EP 0618299 Al se caracteriza porque utiliza el cultivo obtenido después de una incubación adicional durante 6 a 24 horas después de que el cultivo de las células alcance la fase estacionaria, mientras que el pH se mantiene entre 7 y 8,3. Y el método de la EP 0636695 Al se caracteriza porque la última parte del periodo de la reacción se lleva a cabo a una temperatura menor de 25ºC con la condición de que existan cristales anhidros de L-dopa en la mezcla de reacción, mientras que el L-dopa se forma y precipita en forma de cristales anhidros, los cuales se obtienen de la mezcla.

En el documento US 5,837,504 (Xun et al.), publicada el 17 de noviembre de 1998, se reivindica un método para producir L-dopa a partir de L-tirosina que comprende a) la oxidación de la L-tirosina añadiendo dicha tirosina y un sustrato a una suspensión de células para generar NADH, formándose una mezcla de reacción; y b) incubando dicha mezcla de reacción durante un tiempo con el consumo de oxigeno molecular y NADH para producir el L-dopa. La suspensión de células se prepara a partir de una de las bacterias del grupo formado por E. coli W, E. coli S17? y E. coli DH1 que expresan la actividad 4-hidroxifenilacetato 3-hidroxilasa. El sustrato consiste en moléculas pequeñas de ácidos o alcoholes orgánicos y sus combinaciones.

En el documento de patente WO 2004/015094 A1 (DSM IP ASSETS B.V. y DMS BIOTECH GMBH), publicado el 19 de febrero de 2004, mencionan que en el proceso de US 5,837,504 al tener lugar las fermentaciones en medio acuoso, el L-dopa se oxida formando productos de polimerización marrones o negros, y que su objetivo es proporcionar un proceso de producción fermentativa en el que el L-dopa obtenido sea estable. El L-dopa se produce por fermentación aeróbica de un microorganismo recombinante que posee actividad de L-tirosina-3- hidroxi-mono-oxigenasa y la ruta metabólica: glicólisis, ruta del fosfato pentosa, ruta del aminoácido aromático, o de sus derivados, que comprende: a) fase de crecimiento y fase de producción, en la que se produce L-dopa en el medio de fermentación, y b) fase de finali-zación, en la que L-dopa se produce a partir de una fuente de carbono y el pH es de 1 a 7 al menos en esta última fase.

Los autores de la presente solicitud, durante el estudio de genes que putativamente codifican polifenol oxidaras (PPOs) en bacterias interaccionando con plantas en general y con microbios patógenos en particular pensaron que existe una conexión entre la capacidad de los microorganismos de expresar las actividades de las PPOs y la infección. Para examinar esta posibilidad eligieron la Ralstonia solanacearum como modelo apropiado para ver si esas actividades realmente se expresan en los microorganismos, ya que este organismo cuyo genoma se ha secuenciado, es una bacteria patógena que causa que plantas como la patata y el tomate se marchiten y mueran. Dichos autores encontraron que al menos tres genes se expresan y las proteínas muestran actividad PPO (Applied and Enviromental Microbiology, 71, 6808-6815; 2005). Continuando con los estudios de las actividades de las PPO producidas por la R. solanacearum (FEBS Journal, 273, 257-270; 2006), los autores de la presente solicitud han encontrado de forma sorprendente que de las dos PPOs que actúan como tirosinasas, con números de acceso NP_519622 y NP_518458, su actividad es distinta. La NP_519622 es una enzima con una clara preferencia de oxidación de o-difenoles no carboxilados y solo posee una actividad monofenolasa residual, comportándose como una catecol oxidasa. Al contrario que todas las tirosinasas hasta ahora estudiadas, y de forma inesperada se ha encontrado que la NP_518458 posee una mayor actividad como monofenolasa que o-difenolasa, es decir, que posee una actividad de tirosina hidroxilasa (TH) mayor que de dopa oxidasa (DO), y además su actividad inicial no depende apenas de la presencia de un cofactor L-dopa.

La presente invención, por tanto, se refiere a un procedimiento de obtención de L-dopa a partir de L-tirosina utilizando la enzima tirosinasa NP_518458 (denominada a partir de ahora por su número de acceso) procedente de la Ralstonia solanacearum, procedimiento mejorado en relación a los existentes ya que la tirosinasa NP_518458 de R. solanacearum tiene una actividad hidroxilante muy efectiva y permite la acumulación de todo el L-dopa formado, lo cual no ocurre en las tirosinasas descritas en el estado de la técnica. La principal desventaja del uso de otras tirosinasas es precisamente la oxidación no deseada del dopa que se va acumulando, con la consiguiente pérdida del producto deseado y por tanto económica.

Descripción de la invención

Para una eficiente expresión de la enzima, y teniendo en cuenta además que se trata de un patógeno bacteriano, el gen que codifica esta enzima será amplificado utilizando como molde DNA genómico de Ralstonia solanacearum GMI1000 y utilizando cebadores adecuados con sitios de restricción que...

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de producción de 3,4-dihidroxifenil-L-alanina a partir de L-tirosina, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a)utilización de la enzima NP_518458, obtenida del microorganismo Ralstonia solanacearum como tirosinasa; b)clonación y expresión de la enzima NP_518458 en una cepa de E. coli; y c)bioconversión de la L-tirosina en 3,4-dihidroxifenil-L-alanina por: (i)adición de L-tirosina directamente al cultivo bacteriano; o (ii)preparación de extractos celulares conteniendo la enzima NP_518458; o (iii)aislamiento, purificación y fijación a un soporte inerte de la enzima NP_518458 que actuará de catalizador en la oxidación de la L-tirosina para formar la 3,4-dihidroxifenil-L-alanina.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que la etapa c) tiene lugar aun pH entre 2 y 7.

3. Procedimiento según las reivindicaciones 1 y 2, en el que la etapa c) tiene lugar a un pH entre 4 y 6.

4. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 3, en el que la etapa c) tiene lugar a un pH 5.

5. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 4, en el que la etapa c) tiene lugar a temperatura no superior a 37ºC.

6. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 5, en el que la etapa c) tiene lugar de 25ºC a 30ºC.

7. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 6 en el que se añade EDTA como agente quelante en concentraciones inferiores a 0.1 mM.

8. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7 en el que hay presente algún agente reductor.

9. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 7 en el que el agente reductor es el ácido ascórbico.

10. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 9 en el que se añada SDS como agente estimulador de la tirosinasa a una concentración entre 0.01% y 0.1%.

11. Procedimiento según las reivindicaciones 1 a 10 en el que se añada SDS como agente estimulador de la tirosinasa a una concentración del 0.05%.

12. Procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones anteriores en el que se excluye la adición de L-Dopa como cofactor.


 

Patentes similares o relacionadas:

NUEVO MICROORGANISMO PARA EL TRATAMIENTO DE AGUAS RESIDUALES Y PROCEDIMIENTO, del 14 de Julio de 2011, de ECO SOLUTION: Microorganismo aislado, caracterizado por que se trata de la cepa CNCM l-3448 de Alcaligenes faecalis capaz de realizar: i) la transformación de nitrógeno Kjeldahl, de […]

NUEVO USO DE ACILASA DE PENICILINA G DE ALCALIGENES FAECALIS., del , de DSM N.V.: SE PREVEN LAS APLICACIONES DE UNA ACILASA G DE PENICILINA DE ALCALIGENES FAECALIS PARA LA DESACILACION DE ALGUNOS ACIDOS CEFALOSPORANICOS Y PENICILINICOS Y DERIVADOS […]

Imagen de 'MUTANTE DE TIROSINASA Y PROCEDIMIENTOS DE UTILIZACION DEL MISMO'MUTANTE DE TIROSINASA Y PROCEDIMIENTOS DE UTILIZACION DEL MISMO, del 2 de Diciembre de 2009, de UNITED THERAPEUTICS CORPORATION: Polipéptido que comprende un mutante de tirosinasa, en el que el mutante de tirosinasa es capaz de acumularse en el retículo endoplasmático […]

Métodos para controlar la producción de proteasas, del 1 de Julio de 2020, de ROAL OY: Una célula hospedadora que comprende al menos un gen cromosómico inactivado en donde el gen cromosómico inactivado comprende una secuencia de ácido nucleico que codifica un […]

Productos y métodos para el tratamiento de la esclerosis lateral amiotrófica, del 27 de Mayo de 2020, de The Research Institute at Nationwide Children's Hospital: Un virus recombinante adenoasociado que comprende el ADN que codifica el ARNhc de la dismutasa de superóxido 1 (SOD1) CATGGATTCCATGTTCATGA (SEQ ID NO: […]

Reconocimiento de unión a diana celular mediante un agente bioactivo usando transferencia de energía de resonancia de bioluminiscencia intracelular, del 6 de Mayo de 2020, de PROMEGA CORPORATION: Un sistema de ensayo que comprende: (a) una biblioteca de agentes bioactivos, cada uno de los cuales está fijado a un fluoróforo; (b) una diana celular fusionada a […]

Luciferasas de Oplophorus sintéticas con mayor emisión de luz, del 15 de Abril de 2020, de PROMEGA CORPORATION: Método que comprende: (a) expresar un polipéptido de luciferasa en una célula, en el que el polipéptido de luciferasa es una luciferasa modificada […]

Métodos para ajustar los niveles de producción de carotenoides y composiciones en géneros de Rhodosporidium y Rhodotorula, del 15 de Abril de 2020, de TEMASEK LIFE SCIENCES LABORATORY LIMITED: Un método para ajustar el nivel de producción y la composición de carotenoides en un huésped fúngico que comprende: (a) manipular genéticamente […]

Utilizamos cookies para mejorar nuestros servicios y mostrarle publicidad relevante. Si continua navegando, consideramos que acepta su uso. Puede obtener más información aquí. .