Procedimiento de obtención de un aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente.

Procedimiento de obtención de un aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente, que comprende

(a) cultivar trozos de hueso de dicho paciente en el medio DMEM alto en glucosa (4500 mg/L glucosa), glutamina 1%, piruvato 1%, penicilina/estreptomicina 1% y 20% de suero sanguíneo de dicho paciente durante 3-4 semanas, obteniéndose un cultivo de osteoblastos, (b) añadir tripsina y el medio definido en la etapa (a) y centrifugar, eliminando el sobrenadante, (c) sembrar los osteoblastos obtenidos en la etapa (b) y repetir a los 5-9 días la etapa (b), (d) cultivar los osteoblastos obtenidos en la etapa (c) sobre fragmentos de aloinjerto óseo humano en presencia del medio definido en la etapa (a), incubar durante 40-56 horas y centrifugar, eliminando el sobrenadante, añadir suero obtenido del paciente, centrifugar y descartar el sobrenadante, obteniendo el aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente.

Tipo: Patente de Invención. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: P201430629.

Solicitante: INSTITUTO DE INVESTIGACIÓN SANITARIA - FUNDACIÓN JIMÉNEZ DÍAZ.

Nacionalidad solicitante: España.

Inventor/es: ÁLVAREZ GALOVICH,Luis, DE LA PIEDRA GORDO,Concepción.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PROCEDIMIENTOS O APARATOS PARA ESTERILIZAR MATERIALES... > Materiales para prótesis o para revestimiento de... > A61L27/38 (Células animales (para utilizar en piel artificial A61L 27/60))
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > FILTROS IMPLANTABLES EN LOS VASOS SANGUINEOS; PROTESIS;... > Filtros implantables en los vasos sanguíneos; Prótesis,... > A61F2/28 (Huesos (articulaciones A61F 2/30))
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Células no diferenciadas humanas, animales o vegetales,... > C12N5/071 (Células o tejidos de vertebrados, p.ej. células o tejidos humanos)

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento de obtenciïn de un aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente.

CAMPO DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn estï relacionada con el cultivo de osteoblastos sobre aloinjertos. En particular, la presente invenciïn es un procedimiento de obtenciïn de un aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente. El aloinjerto enriquecido con osteoblastos obtenidos de un paciente se puede utilizar en la artrodesis de columna, tratamiento principal de diversas patologïas de la columna.

ANTECEDENTES DE LA INVENCIïN

Determinadas patologïas de la columna, tales como las discopatïas, espondilolistesis, etc., producen una situaciïn de inestabilidad regional que pueden acabar desarrollando un cuadro de dolor y afectaciïn de las estructuras nerviosas adyacentes. El tratamiento de estas patologïas estï basado en la fusiïn de los segmentos afectados mediante artrodesis posterolateral de las apïfisis transversas de las vïrtebras. El material considerado como “patrïn oro” para conseguir una buena fusiïn de los segmentos artrodesados es el

autoinjerto de cresta ilïaca. Sin embargo, el uso del autoinjerto estï limitado a un volumen determinado y su uso no estï exento de complicaciones hasta en un 30% de los pacientes. Es por ello que durante los ïltimos aïos se ha estado investigando en el uso de diferentesalternativas. Entre ellos se encuentra la Matriz ïsea desmineralizada, o los sustitutos de diferentes combinaciones de fosfato cïlcico. Todos ello tienen sus limitaciones, y ninguno ha conseguido unas tasas de artrodesis similares o superiores al autoinjerto. Salvo la BMP.

La BMP es una proteïna precursora de hueso, que durante los ïltimos aïos ha tomado gran relevancia. Diferentes estudios clïnicos demostraban unas tasas de artrodesis similares, e incluso superiores al Autoinjerto, y su uso se ha generalizado, especialmente en la columna. Sin embargo, durante los ïltimos dos aïos ha habido una enorme polïmica respecto a esos estudios, donde al parecer los datos no eran del todo correctos, y se dejaron de reportar una tasa elevada de serias complicaciones, incluida cïncer.

El problema que plantea la tïcnica consiste en proporcionar un procedimiento a los descritos en el estado de la tïcnica para obtener un aloinjerto enriquecido con osteoblastos.

La presente invenciïn, tal y como se define en las reivindicaciones, proporciona una soluciïn a este problema tïcnico.

DESCRIPCIïN DE LA INVENCIïN

La presente invenciïn proporciona un procedimiento de obtenciïn de un aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente, que comprende:

(a) cultivar trozos de hueso de dicho paciente en el medio DMEM alto en glucosa (4500 mg/L glucosa) , glutamina 1%, piruvato 1%, penicilina/estreptomicina 1% y 20% de suero sanguïneo de dicho paciente durante 3-4 semanas, obteniïndose un cultivo de osteoblastos,

(b) aïadir tripsina y el medio definido en la etapa (a) y centrifugar, eliminando el sobrenadante,

(c) sembrar los osteoblastos obtenidos en la etapa (b) y repetir a los 5-9 dïas la etapa (b) y

(d) cultivar los osteoblastos obtenidos en la etapa (c) sobre fragmentos de aloinjerto ïseo humano en presencia del medio definido en la etapa (a) , incubar durante 40-56 horas y centrifugar, eliminando el sobrenadante, aïadir suero obtenido del paciente, centrifugar y

descartar el sobrenadante, obteniendo el aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente, en adelante, procedimiento de la invenciïn.

Otra realizaciïn es el procedimiento de la invenciïn, donde en la etapa (c) , la etapa (b) se repite a los 7 dïas.

Y otra realizaciïn es el procedimiento de la invenciïn, donde en la etapa (d) , se incuba durante 48 horas.

El aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente obtenido por el procedimiento de la invenciïn se utilizarï en una cirugïa de artrodesis de columna.

La cirugïa estï indicada para pacientes con una espondiloartrosis con inestabilidad asociada que no hayan respondido a un tratamiento conservador previo, y que se presenten con dolor lumbar y/o signos de estenosis de canal, con/sin radiculopatïa asociada.

La intervenciïn quirïrgica se puede realizar aproximadamente 6 semanas despuïs de la biopsia (en el momento de estar completa la etapa (d) ) . Por una vïa posterior estïndar se realiza un acceso a la regiïn posterior lumbar. Se realizan las maniobras de descompresiïn necesarias e instrumentaciïn del segmento inestable con Tornillo Omega 21 cementados. Una vez preparado el espacio intertransverso, con cruentaciïn de la cortical posterior de las transversas, se coloca en un lado 15 cc de aloinjerto fragmentado obtenido por el procedimiento de la invenciïn, y en el lado contralateral 15 cc de aloinjerto fragmentado obtenido por el procedimiento de la invenciïn.

El procedimiento de la invenciïn permite obtener un material para injerto con mayor potencial osteogïnico, osteoinductor y osteoconductor que el del propio autoinjerto (“patrïn oro”) , lo que clïnicamente supone una mayor la velocidad de incorporaciïn del injerto en la artrodesis de columna El procedimiento de la invenciïn tambiïn permite eliminar en el paciente las molestias (dolor, infecciones superficiales, etc.) y posibles complicaciones secundarias a la obtenciïn del autoinjerto (hernia abdominal, lesiïn vascular, infecciïn profunda, lesiïn neurolïgica, fractura del ala ilïaca, disfunciïn sexual, etc.) .

MODOS DE REALIZACIïN PREFERENTE

Ejemplo 1. Evaluaciïn de la acciïn osteogïnica ejercida por la adiciïn de aloinjerto de hueso enriquecido con osteoblastos en la artrodesis de columna, en un modelo animal

Se utilizaron conejos de 4, 5-5 kg de peso en los que se realiza una artrodesis posterolateral L5-L6 bilateral. Se analizan tres grupos experimentales; APL con autointerto de cresta iliaca (Grupo I) , APL con aloinjerto de cresta iliaca (Grupo II) y APL con una mezcla de aloinjerto de cresta iliaca enriquecida con un cultivo de osteoblastos durante 48 horas. Los animales fueron sacrificados a las 3 y 6 semanas, realizando un anïlisis histolïgico, radiolïgico y biomecïnico de las piezas.

Se realizaron ensayos biomecïnicos. Los segmentos fusionados se montaron en un sistema para la realizaciïn de ensayos biomecïnicos. Se aplicï una carga idïntica a los segmentos L5-L6. La distancia de desplazamiento de la vïrtebra superior se evaluï para reflejar la rigidez de los segmentos de fusiïn.

Los ensayos biomecïnicos demostraron que el grupo III era estadïsticamente mïs rïgido a la flexiïn que los grupos I y II en el pico de resistencia mïxima, realizando ensayos de flexiïn a una velocidad de 0, 5 cm/min controlando la carga para un desplazamiento de 1mm, 2mm y 3 mm con el trazador.

Se realizï un anïlisis histolïgico. Cada masa de fusiïn, que incluye una porciïn de dos extremos vertebrales se almacenï en soluciïn de formalina tamponada neutra al 10% a 4 ï C durante 24 horas. Los especïmenes no descalcificados se embebieron en metacrilato de metilo y se seccionaron con un microtomo (POLYCUS, Alemania) con un espesor de 5 m. Secciones contiguas se tiïeron con azul de toluidina.

En el anïlisis histolïgico, el grupo III demostrï un desarrollo de la artrodesis mucho mïs prolïfico en crecimiento celular que los grupos I y II. El injerto utilizado tenïa un abundante relleno trabecular en el grupo III con proliferaciïn osteoblïstica. La mayor complicaciïn encontrada fue que en el grupo III hubo una tasa mas elevada de animales que fallecieron durante las 24 horas de la cirugïa.

Ejemplo 2. Crecimiento de osteoblastos humanos de acuerdo al procedimiento de la invenciïn.

A un... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de obtenciïn de un aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente, que comprende:

(a) cultivar trozos de hueso de dicho paciente en el medio DMEM alto en glucosa (4500 mg/L glucosa) , glutamina 1%, piruvato 1%, penicilina/estreptomicina 1% y 20% de suero sanguïneo de dicho paciente durante 3-4 semanas, obteniïndose un cultivo de osteoblastos,

(b) aïadir tripsina y el medio definido en la etapa (a) y centrifugar, eliminando el sobrenadante,

(c) sembrar los osteoblastos obtenidos en la etapa (b) y repetir a los 5-9 dïas la etapa (b) y

(d) cultivar los osteoblastos obtenidos en la etapa (c) sobre fragmentos de aloinjerto ïseo humano en presencia del medio definido en la etapa (a) , incubar durant.

4. 56 horas y centrifugar, eliminando el sobrenadante, aïadir suero obtenido del paciente, centrifugar y descartar el sobrenadante, obteniendo el aloinjerto enriquecido con osteoblastos de un paciente.

2. Procedimiento segïn la reivindicaciïn 1, caracterizado por que en la etapa (c) , la etapa (b) se repite a los 7 dïas.

3. Procedimiento segïn una de las reivindicaciones 1 ï 2, caracterizado por que en la etapa (d) , se incuba durante 48 horas.

OFICINA ESPAïOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.ï solicitud: 201430629

ESPAïA

Fecha de presentaciïn de la solicitud: 29.04.2014

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categorïa 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X XU L., et al. An experimental study of bioderived bone to repair bone defects as a scaffold of tissue engineering. International surger y Italy Nov-Dic 2008. VOL: 93 No: 6 Pïgs.

37. 380 ISSN 0020-8868 (Impreso) . Doi: pubmed:20085049. Ver todo el documento, especialmente pïginas 378 y 380. 1-3

X MIRON, R. J., et al. Osteogenic potential of autogenous bone grafts harvested with four different surgical techniques. Journal of dental research United States Dic 2011, VOL: 90 No: 12, Pïgs: 1428-1433 ISSN 1544-0591 (Electrïnico) Doi: doi:10.1177/0022034511422718 pubmed:21940523. Ver todo el documento, especialmente Resumen, primer y segundo partados de Materiales y mïtodos, y Discusiïn. 1-3

X NOLAN, P. C., et al. Culture of human osteoblasts on demineralised human bone. Possible means of graft enhancement. The Journal of bone and joint surger y . British volume ENGLAND Mar 1992 VOL: 74 No: 2 Pïgs.

28. 286 ISSN 0301-620X (Impreso) Doi: pubmed:1312095. Ver todo el documento. 1-3

X BEGLEY, C. T., et al. The culture of human osteoblasts upon bone graft substitutes. Bone UNITED STATES Jul-Agosto 1993 VOL: 14 No: 4 Pïgs.

66. 666 ISSN 8756-3282 (Impreso) Doi: pubmed:8274310. Ver todo el documento, especialmente Resumen y Materiales y mïtodos. 1-3

X HINZE, M. C., et al. Bone engineering-vitalisation of alloplastic and allogenic bone grafts by human osteoblast-like cells. The British journal of oral & maxillofacial surger y Scotland Jul 2010 VOL: 48 No: 5 Pïgs.

36. 373 ISSN 1532-1940 (Electrïnico) Doi: doi:10.1016/j.bjoms.2009.06.011 pubmed:19596502. Ver todo el documento, especialmente Resumen y primer y segundo apartados de Materiales y mïtodos. 1-3

X YANG Y., et al. Naringin induces bone marrow mesenchymal stem cells to repair femoral head necrosis in rabbits. Chinese Journal of Tissue Engineering Research. Journal of Clinical Rehabilitative chn. 01.12.2013 VOL: 16 No: 49 Pïgs: 9232-9235 (resumen) . ISSN 1673-8225 (impreso) . Doi: doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.020. EMBASE / Elsevier [en lïnea]. [recuperado el 11.06.2014]. Recuperado de: EPOQUENET, EPO, nï de acceso EMB-2013673924. Ver todo el documento. 1-3

Categorïa de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categorïa A: refleja el estado de la tïcnica O: referido a divulgaciïn no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaciïn de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despuïs de la fecha de presentaciïn de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nï:

Fecha de realizaciïn del informe 18.06.2014 Examinador B. Pïrez Esteban Pïgina 1/6

OFICINA ESPAïOLA DE PATENTES Y MARCAS

N.ï solicitud: 201430629

ESPAïA

Fecha de presentaciïn de la solicitud: 29.04.2014

Fecha de prioridad:

INFORME SOBRE EL ESTADO DE LA TECNICA

51 Int. Cl. : Ver Hoja Adicional

DOCUMENTOS RELEVANTES

Categorïa 56 Documentos citados Reivindicaciones afectadas

X NATHER A., et al. Effect of autologous mesenchymal stem cells on biological healing of allografts in critical-sized tibial defects simulated in adult rabbits. Annals of the Academy of Medicine, Singapore Singapore Agosto 2010 VOL: 39 No: 8 Pïgs.

59. 606 ISSN 0304-4602 (Impreso) Doi: pubmed:20838700. Ver todo el documento, especialmente Resumen, Materiales y mïtodos, y Discusiïn. 1-3

X FAN, Z-X., et al. Placenta-versus bone-marrow-derived mesenchymal cells for the repair of segmental bone defects in a rabbit model. The FEBS journal England Jul 2012 VOL: 279 No: 13 Pïgs: 2455-2465 ISSN 1742-4658 (Electrïnico) Doi: doi:10.1111/j.1742-4658.2012.08625.x pubmed:22564891. Ver todo el documento. 1-3

X ZOU, X. H., et al. A novel strategy incorporated the power of mesenchymal stem cells to allografts for segmental bone tissue engineering. Cell transplantation United States 2009 VOL: 18 No: 4 Pïgs.

43. 441 ISSN 0963-6897 (Impreso) Doi: doi:10.3727/096368909788809839 pubmed:19622230. Ver todo el documento. 1-3

A JONSSON, K. B., et al. Three isolation techniques for primar y culture of human osteoblast-like cells: a comparison. Acta orthopaedica Scandinavica NORWAY Agosto 1999 VOL: 70 No: 4 Pïgs.

36. 373 ISSN 0001-6470 (Impreso) Doi: pubmed:10569267. Ver todo el documento. 1-3

Categorïa de los documentos citados X: de particular relevancia Y: de particular relevancia combinado con otro/s de la misma categorïa A: refleja el estado de la tïcnica O: referido a divulgaciïn no escrita P: publicado entre la fecha de prioridad y la de presentaciïn de la solicitud E: documento anterior, pero publicado despuïs de la fecha de presentaciïn de la solicitud

El presente informe ha sido realizado • para todas las reivindicaciones • para las reivindicaciones nï:

Fecha de realizaciïn del informe 18.06.2014 Examinador B. Pïrez Esteban Pïgina 2/6

INFORME DEL ESTADO DE LA TïCNICA

CLASIFICACIïN OBJETO DE LA SOLICITUD A61L27/38 (2006.01)

A61F2/28 (2006.01) C12N5/071 (2010.01) Documentaciïn mïnima buscada (sistema de clasificaciïn seguido de los sïmbolos de clasificaciïn)

A61L, A61F, C12N

Bases de datos electrïnicas consultadas durante la bïsqueda (nombre de la base de datos y, si es posible, tïrminos de bïsqueda utilizados) INVENES, EPODOC, WPI, MEDLINE, BIOSIS, NPL, EMBASE, Google acadïmico.

OPINIïN ESCRITA

Fecha de Realizaciïn de la Opiniïn Escrita: 18.06.2014

Declaraciïn

Novedad (Art. 6.1 LP 11/1986) Reivindicaciones Reivindicaciones 1-3 SI NO

Actividad inventiva (Art. 8.1 LP11/1986) Reivindicaciones Reivindicaciones 1-3 SI NO

Se considera que la solicitud cumple con el requisito de aplicaciïn industrial. Este requisito fue evaluado durante la fase de examen formal y tïcnico de la solicitud (Artïculo 31.2 Ley 11/1986) .

Base de la Opiniïn.

La presente opiniïn se ha realizado sobre la base de la solicitud de patente tal y como se publica.

OPINIïN ESCRITA

1. Documentos considerados.

A continuaciïn se relacionan los documentos pertenecientes al estado de la tïcnica tomados en consideraciïn para la realizaciïn de esta opiniïn.

Documento Nïmero Publicaciïn o Identificaciïn Fecha Publicaciïn

D01 XU L., et al. International surger y Italy Nov-Dic 2008. VOL: 93 No: 6 Pïgs.

37. 380 ISSN 0020-8868 (Impreso) . Doi: pubmed:20085049. Nov-Dic 2008

D02 MIRON, R. J., et al. Journal of dental research United States Dic 2011, VOL: 90 No: 12, Pïgs: 1428-1433 ISSN 1544-0591 (Electrïnico) Doi: doi:10.1177/0022034511422718 pubmed:21940523. Dic 2011

D03 NOLAN, P. C., et al. The Journal of bone and joint surger y . British volume ENGLAND Mar 1992 VOL: 74 No: 2 Pïgs.

28. 286 ISSN 0301-620X (Impreso) Doi: pubmed:1312095. Marzo 1992

D04 BEGLEY, C. T., et al. Bone UNITED STATES Jul-Agosto 1993 VOL: 14 No: 4 Pïgs.

66. 666 ISSN 8756-3282 (Impreso) Doi: pubmed:8274310. Jul-Agosto1993

D05 HINZE, M. C., et al. The British journal of oral & maxillofacial surger y Scotland Jul 2010 VOL: 48 No: 5 Pïgs.

36. 373 ISSN 1532-1940 (Electrïnico) Doi: doi:10.1016/j.bjoms.2009.06.011 pubmed:19596502. Jul 2010

D06 YANG Y., et al. Chinese Journal of Tissue Engineering Research. Journal of Clinical Rehabilitative chn. 01.12.2013 VOL: 16 No: 49 Pags: 9232-9235 (resumen) . ISSN 1673-8225 (impreso) . Doi: doi:10.3969/j.issn.2095-4344.2012.49.020. EMBASE / Elsevier [en lïnea] [recuperado el 11.06.2014]. Recuperado de: EPOQUENET, EPO, nï de acceso EMB-2013673924. 01.12.2013

D07 NATHER A., et al. Annals of the Academy of Medicine, Singapore Singapore Agosto 2010 VOL: 39 No: 8 Pïgs.

59. 606 ISSN 0304-4602 (Impreso) Doi: pubmed:20838700. Agosto 2010

D08 FAN, Z-X., et al. The FEBS journal England Jul 2012 VOL: 279 No: 13 Pïgs: 2455-2465 ISSN 1742-4658 (Electrïnico) Doi: doi:10.1111/j.1742-4658.2012.08625.x pubmed:22564891. Jul 2012

D09 ZOU, X. H., et al. Cell transplantation United States 2009 VOL: 18 No: 4 Pïgs.

43. 441 ISSN 0963-6897 (Impreso) Doi: doi:10.3727/096368909788809839 pubmed:19622230. 2009

D10 JONSSON, K. B., et al. Acta orthopaedica Scandinavica NORWAY Agosto 1999 VOL: 70 No: 4 Pïgs.

36. 373 ISSN 0001-6470 (Impreso) Doi: pubmed:10569267. Agosto 1999

2. Declaraciïn motivada segïn los artïculos 29.6 y 29.7 del Reglamento de ejecuciïn de la Ley 11/1986, de 20 de marzo, de Patentes sobre la novedad y la actividad inventiva; citas y explicaciones en apoyo de esta declaraciïn La presente solicitud de patente describe y reivindica un procedimiento de obtenciïn de un aloinjerto de hueso enriquecido con osteoblastos, que comprende las etapas de obtener trozos de hueso de un paciente y cultivarlos en medio DMEM suplementado con glucosa, glutamina, piruvato, antibiïticos y suero del paciente durante 3-4 semanas, para obtener los osteoblastos, tripsinizar el cultivo, centrifugarlo y cultivar durant.

4. 56 horas los osteoblastos asï obtenidos sobre fragmentos de aloinjerto ïseo humano en el medio de la etapa anterior, centrifugar, aïadir suero al precipitado, centrifugar de nuevo y descartar el sobrenadante, con lo que se obtiene el aloinjerto enriquecido en osteoblastos del paciente.

No se ha encontrado en el estado de la tïcnica ningïn documento que divulgue un procedimiento con las mismas caracterïsticas tïcnicas que el reivindicado en la presente solicitud, por lo que las reivindicaciones 1 a 3 de la solicitud se consideran nuevas, segïn el artïculo 6 de la Ley 11/1986 de Patentes.

Se han encontrado, sin embargo, numerosos documentos que divulgan injertos ïseos que contienen osteoblastos, y sus procedimientos de obtenciïn, y que, como se comenta a continuaciïn, afectan la actividad inventiva de las reivindicaciones 1 a 3 de la solicitud, segïn el artïculo 8 de la Ley de Patentes.

OPINIïN ESCRITA

Los documentos D01 a D05 describen injertos constituidos, como el de la solicitud, por fragmentos ïseos en los que se siembran osteoblastos aislados de hueso. Si bien los soportes ïseos son alogïnicos en la mayorïa de los ejemplos, en un caso el hueso es autïgeno; no se considera que esta diferencia con el estado de la tïcnica dote a la solicitud de actividad inventiva, pues en ella no se indica que el uso de aloinjertos suponga un avance significativo respecto a los autoinjertos, por lo que la elecciïn de uno u otro soporte serïa mïs bien una mera alternativa al problema tïcnico planteado. Tambiïn se aprecian diferencias entre estos documentos y la presente solicitud en cuanto a la manera de aislar los osteoblastos del hueso, ya que en unos casos se emplean procedimientos enzimïticos y en otros se aïslan los osteoblastos por cultivo en medio definido, como en la solicitud. Dado que el solicitante no justifica que el mïtodo empleado en la solicitud represente una ventaja frente a los ya existentes en el campo tïcnico, se considera que el empleo de uno u otro mïtodo de obtenciïn (que serïan alternativas conocidas en el estado de la tïcnica) , no aporta actividad inventiva a las reivindicaciones 1 a 3 de la solicitud. De hecho, en el documento D02 se describen diferentes tïcnicas de obtenciïn de osteoblastos, y en el documento D10, citado al final de este informe, tambiïn se divulgan varias formas de obtenciïn de osteoblastos a partir de tejido ïseo, lo que indica que se trata de procedimientos conocidos y ampliamente utilizados en el estado de la tïcnica. Por tanto, las reivindicaciones 1 a 3 de la solicitud no tienen actividad inventiva a la luz de lo divulgado en los documentos D01 a D05, segïn el artïculo 8 de la Ley de Patentes.

En el documento D06 se describe tambiïn un aloinjerto ïseo enriquecido con osteoblastos. La diferencia fundamental con el descrito en la solicitud es que en D06 los osteoblastos no se obtienen de hueso, sino de cïlulas madre mesenquimales; de hecho, el artïculo consiste en demostrar la utilidad de un compuesto para reparar lesiones ïseas por su capacidad de inducir la diferenciaciïn de cïlulas madre mesenquimales a osteoblastos, que posteriormente se depositan en aloinjertos ïseos y se emplean en regeneraciïn de tejido femoral. A pesar de que en este documento del estado de la tïcnica la fuente celular sea diferente a la de la solicitud, dado que para la resoluciïn del problema tïcnico de generar un alonjerto ïseo enriquecido con osteoblastos, se emplean en la solicitud y en D06 opciones ampliamente conocidas en el estado de la tïcnica, se estima que la informaciïn divulgada en D06 afecta la actividad inventiva de las reivindicaciones 1 a 3 de la solicitud, segïn el artïculo 8 de la Ley de Patentes.

Tambiïn en los documentos D07, D08 y D09 se describe la generaciïn de aloinjertos ïseos que contienen osteoblastos. La diferencia con los documentos anteriores es que en estos tres casos, los fragmentos ïseos se cargan con cïlulas madre mesenquimales que se diferencian a osteoblastos en el propio injerto. Como se ha comentado anteriormente, la diferenciaciïn de cïlulas madre mesenquimales a cïlulas de linaje osteoblïstico es ampliamente conocida en el estado de la tïcnica, por lo que no se considera una mejora significativa emplear osteoblastos aislados de hueso (por tïcnicas conocidas) en lugar de cïlulas madre mesenquimales que se diferenciarïn a osteoblastos (proceso tambiïn ampliamente conocido en el estado de la tïcnica) . Por consiguiente, tambiïn la informaciïn divulgada en los documentos D07 a D09 afecta la actividad inventiva de las reivindicaciones 1 a 3 de la solicitud, segïn el artïculo 8 de la Ley de Patentes.