Un método para producir virus a partir de un cultivo de células,

que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de células que se han infectado con el virus;

(b) extraer el virus de las células añadiendo un detergente al cultivo de células e incubando durante un periodo de tiempo para producir un lisado celular; y

(c) retirar los residuos celulares;

(d) purificar el virus mediante una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular;

(e) recoger el virus.

Métodos de purificación viral mejorados.

Esta solicitud reivindica el beneficio de las solicitudes provisionales de EEUU nº de serie 60/377.273, presentada el 30 de abril, 2002; y nº de serie 60/443.176, presentada el 29 de enero, 2003.

Este invención se refiere a un método para extraer virus a partir de un cultivo celular. En particular, el método resulta útil para extraer virus infecciosos que es adecuado para la administración clínica a mamíferos, incluyendo el ser humano.

Referencias bibliográficas

Solicitud de patente de EEUU nº de publicación 20020037576, publicada el 28 de marzo, 2002.

Documento WO99/08692A1, publicado el 25 de febrero, 1999.

Patente japonesa 63044532A, publicada el 25 de febrero, 1988.

Berry et al., Biotechnology and Bioengineering, "Production of Reovirus Type-1 and Type-3 from Vero Cells Grown on Solid and Macroporous Microcarriers", Biotechnology and Bioengineering, 62:12-19 (1999).

Bos, J.L., "Ras Oncogene in Human Cancer: A Review", Canc. Res., 49(17):4682-4689 (1989).

Chandron y Nibert, "Protease cleavage of reovirus capsid protein mu1 and mu1C is blocked by alkyl sulfate detergents, yielding a new type of infectious subvirion particle", J. of Virology, 72(1):467-475 (1998).

Coffey, M.C. et al., "Reovirus therapy of tumors with activated Ras pathway", Science, 282:1332-1334 (1998).

Davis et al., Microbiology, Lippincott, Filadelfia (1990).

Drastini, Y. et al., "Comparison of eight different procedures for harvesting avian reoviruses grown in Vero cells", J. Virological Methods, 39:269-278 (1992).

Duncan et al., "Conformational and functional analysis of the C-terminal globular head of the reovirus cell attachment protein", Virology, 182(2):810-819 (1991).

Fields, B.N. et al., Fundamental Virology, 3ª edición, Lippincott-Raven (1996).

Mah et al., "The N-terminal quarter of reovirus cell attachment protein sigma 1 possesses intrinsic virion-anchoring function", Virology, 179(1):95-103 (1990).

McRae, M.A. y Joklik, W.K., "The nature of the polypeptide encoded by each of the 10 double-stranded RNA segments of reovirus type 3", Virology, 89:578-593 (1979).

Nibert et al., "Reovirus and their replication", en Fields et al., Fundamental Virology, 3ª edición, Lippincott-Raven (1996).

Remington's Pharmaceutical Sciences, Mack Publishing Company, Filadelfia, PA, 19ª edición (1995).

Smith, R.E. et al., "Polypeptide components of virions, top component and cores of reovirus type 3", Virology, 39:791-800 (1969).

Strong, J.E. y P.W. Lee, "The v-erbV oncogene confers enhanced cellular susceptibility to reovirus infection", J. Virol., 70:612-616 (1996).

Strong, J.E. et al., "Evidence that the Epidermal Growth Factor Receptor on Host Cells Confers Reovirus Infection Efficiency", Virology, 197(1):405-411 (1993).

Strong, J.E. et al., "The molecular basis of viral oncolysis: usurpation of the Ras signaling pathway by reovirus", EMBO J., 17:3351-3362 (1998).

Taber et al., "The selection of virus-resistant Chinese hamster ovary cells", Cell, 8:529-533 (1976).

Turner y Duncan, "Site directed mutagenesis of the C-terminal portion of reovirus protein sigma1: evidence for a conformation-dependent receptor binding domain", Virology, 186(1):219-227 (1992).

Debido a la vasta cantidad de enfermedades provocadas por virus, la virología es un campo que se ha estudiado a fondo. Siempre ha existido la demanda de producir virus con eficacia para aislar y purificar proteínas víricas, para generar vacunas o para proporcionar virus infecciosos para estudios de laboratorio. En fechas recientes, los nuevos desarrollos en terapia vírica han aumentado aún más la necesidad de una producción eficaz de virus infecciosos.

La terapia de reovirus es un ejemplo de terapia vírica. El reovirus es un virus de ARN bicatenario capaz de unirse a una multitud de células. Sin embargo, la mayoría de las células no son susceptibles a una infección por reovirus, y la unión del reovirus a su receptor celular no produce replicación vírica ni producción de partículas víricas en estas células. Probablemente ésta sea la razón de por qué no se conoce que el reovirus esté asociado a ninguna enfermedad concreta.

En fechas recientes se ha descubierto que las células transformadas con el oncogén ras se convierten en susceptibles a la infección por reovirus, mientras que sus homólogas no transformadas no son susceptibles (Strong et al., 1998). Por ejemplo, cuando células NIH 3T3 resistentes a reovirus se transforman con Ras activado o con Sos, una proteína que activa a Ras, se potenció la infección por reovirus. De forma similar, fibroblastos de ratón que son resistentes a una infección por reovirus se hacen susceptibles después de su transfección con el gen receptor del EGF o el oncogén v-erbB, que activan ambos la vía de ras (Strong et al., 1993; Strong et al., 1996). Por tanto, el reovirus puede infectar y replicarse selectivamente en células con una vía de Ras activada.

El oncogén ras es el responsable de un gran porcentaje de tumores de mamífero. Se producen mutaciones activadoras del propio gen ras en aproximadamente 30% de todos los tumores humanos (Bos, 1989), principalmente en carcinomas pancreáticos (90%), colorrectales esporádicos (50%) y pulmonares (40%), así como en la leucemia mieloide (30%). La activación de factores cadena arriba o cadena abajo del ras en la vía de ras también está asociada a los tumores. Por ejemplo, la sobreexpresión de HER2/Neu/ErbB2 o del receptor del factor del crecimiento epidérmico (EGF) es común en el cáncer de mama (25-30%), y la sobreexpresión del receptor del factor del crecimiento derivado de plaquetas (PDGF) o del receptor de EGF predomina en gliomas y glioblastomas (40-50%). Se sabe que el receptor de EGF y el receptor de PDGF activan ambos a ras tras su unión a sus respectivos ligandos, y que v-erbB codifica un receptor constitutivamente activado que carece de dominio extracelular.

Puesto que la alteración genética del protooncogén ras o una alta actividad Ras es responsable de un gran número de tumores humanos, la terapia de reovirus es una terapia nueva y prometedora para estas afecciones (Coffey et al., 1998). La terapia de reovirus es muy selectiva para células tumorales asociadas a Ras y no infecta a las células normales. Esta terapia tiene amplias aplicaciones y puede utilizarse en seres humanos y en animales no humanos.

Para producir reovirus adecuados para la administración clínica se necesitan métodos rápidos y eficaces para producir reovirus en células cultivadas. Además, el método tradicional para purificar virus a partir de células cultivadas es tedioso y largo, y hace que el coste de la producción de virus sea demasiado elevado. Por tanto, también se necesita un método mejorado para la purificación de virus.

La presente invención se refiere a un método mejorado para extraer y purificar virus a partir de cultivos celulares que puede aplicarse a la producción de virus a pequeña y a gran escala. El método implica una etapa de extracción sencilla en la que un detergente se añade directamente al cultivo celular. Después pueden retirarse los residuos celulares de la mezcla de extracción, por ejemplo mediante filtración o centrifugación. La suspensión de virus resultante puede concentrarse aún más y/o enriquecerse mediante métodos cromatográficos. El virus preparado según la presente invención puede utilizarse para cualquier fin, incluyendo la purificación de proteínas víricas, la vacunación, la infección de células hospedantes y la administración clínica.

Por consiguiente, un aspecto de la presente invención proporciona un método para... [Seguir leyendo]

1. Un método para producir virus a partir de un cultivo de células, que comprende las etapas de:

(a) proporcionar un cultivo de células que se han infectado con el virus;

(b) extraer el virus de las células añadiendo un detergente al cultivo de células e incubando durante un periodo de tiempo para producir un lisado celular;

(c) retirar los residuos celulares;

(d) purificar el virus mediante una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular; y

(e) recoger el virus.

2. El método de la reivindicación 1, en el que los residuos celulares se retiran mediante filtración.

3. El método de la reivindicación 1, en el que los residuos celulares se retiran mediante una filtración discontinua, que comprende:

(1) filtrar a través de un prefiltro que tiene un tamaño de poro de 5 μM u 8 μM, y

(2) filtrar, después de la etapa (1), a través de un filtro combinado que tiene unos tamaños de poro de 3 μM y 0,8 μM.

4. El método de la reivindicación 1, que comprende además tratar el lisado celular con una enzima de ruptura del ADN.

5. El método de la reivindicación 2, que comprende además concentrar el filtrado.

6. El método de la reivindicación 5, en el que el filtrado se concentra mediante diafiltración.

7. El método de la reivindicación 1, en el que el virus es un virus sin envuelta.

8. El método de la reivindicación 1, en el que el virus es un reovirus.

9. El método de la reivindicación 8, en el que el reovirus es un reovirus de mamífero.

10. El método de la reivindicación 9, en el que el reovirus de mamífero es un reovirus humano.

11. El método de la reivindicación 10, en el que el reovirus humano es un virus de serotipo 3.

12. El método de la reivindicación 11, en el que el reovirus de serotipo 3 es la cepa Dearing.

13. El método de la reivindicación 8, en el que el reovirus es un reovirus recombinante.

14. El método de la reivindicación 1, en el que las células son células de riñón embrionario humano 293 (HEK 293).

15. El método de la reivindicación 14, en el que las células HEK 293 se cultivan en suspensión.

16. El método de la reivindicación 1, que comprende además purificar el virus mediante una cromatografía de intercambio aniónico.

17. Un método para producir reovirus infecciosos, que comprende:

(a) proporcionar un cultivo de células HEK 293 que se han infectado con reovirus;

(b) extraer el virus de las células añadiendo Triton X-100 al cultivo de células HEK 293 e incubando de aproximadamente 25ºC a aproximadamente 37ºC;

(c) tratar la mezcla de la etapa (b) con una enzima de ruptura del ADN;

(d) retirar los residuos celulares mediante filtración;

(e) concentrar el filtrado mediante ultrafiltración o diafiltración;

(f) purificar el reovirus mediante una combinación de cromatografía de intercambio iónico y de exclusión molecular; y

(g) recoger el virus.