PROCEDIMIENTO INMUNOCROMATOGRAFICO.

Un procedimiento inmunocromatográfico caracterizado por comprender las etapas de:

(1) preparación de una muestra obtenida a partir de sangre entera mediante hemolisis de la sangre entera y un tratamiento para posibilitar el revelado cromatográfico,

(2) revelado de la muestra resultante sobre una membrana de revelado para inmunocromatografía, y

(3) revelado de un líquido de lavado sobre la membrana de revelado para inmunocromatografía, con el fin de separar, de esta forma, un pigmento rojo obtenido del eritrocito de la membrana de revelado para inmunocromatografía,

en el que la muestra obtenida a partir de sangre entera se prepara poniendo en contacto la sangre entera con un detergente no iónico, con el fin de hemolizar la sangre entera y solubilizar un componente contenido en la sangre entera, teniendo dicho componente un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro de la membrana de revelado para inmunocromatografía

Procedimiento inmunocromatográfico.

Campo técnico

La presente invención se refiere a un nuevo procedimiento inmunocromatográfico.

Antecedentes de la técnica

Se han desarrollado diversos productos para inmunocromatografía, en los cuales la sangre puede usarse como una muestra a ensayar, pero cuando la sangre entera se revela sin un tratamiento previo sobre una tira o membrana inmunocromatográfica, el revelado inmunocromatográfico generalmente no funciona bien. Para evitar este problema, debería separarse un suero o plasma de la sangre entera con el fin de separar las células de sangre o similares. La centrifugación es un procedimiento principal de separación de plasma/suero. Sin embargo, dado que se requiere una centrífuga para la centrifugación, un médico de medicina general no realiza usualmente la centrifugación en una sala de consulta. Es conocido un procedimiento que usa un filtro, tal como un filtro de plasma (Fuji Film), como otro procedimiento para la separación del plasma, pero igualmente necesita tiempo y es costoso. Además, es necesaria una gran cantidad de sangre entera, puesto que debería ampliarse un área de filtración del filtro de plasma con el fin de separar una cantidad suficiente de plasma sin hemolisis y obstrucción.

Bajo estas circunstancias, se han desarrollado algunos procedimientos en los cuales se ha situado un relleno para una separación de plasma/suero sobre una tira inmunocromatográfica. Más particularmente, el relleno de separación está situado sobre una porción para recibir una muestra de sangre entera en la tira inmunocromatográfica. Cuando se aplica la muestra de sangre entera a la porción receptora, las células de sangre se mantienen en el relleno de separación, de manera tal que no se mueven de la tira inmunocromatográfica durante un tiempo corto, en tanto que en ese tiempo solamente se revelan los componentes del suero sobre la tira inmunocromatográfica.

Los procedimientos anteriores que tienen un relleno de este tipo, comprenden otros diversos dispositivos para prevenir que los eritrocitos de la sangre entera se hemolizen y se separen los componentes del suero de las células de sangre sin hemolisis. Más particularmente, existen muchas solicitudes de patentes y patentes registradas, por ejemplo, la Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) No. 2002-214236 [referencia de patente 1], que usa una membrana de carboximetilcelulosa como una membrana para capturar células de sangre, la Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) No. 2002-350428 [referencia de patente 2], que usa propanol y/o acrilamida, o la Patente Japonesa No. 2940990 [referencia de patente 3], que usa una substancia porosa sinterizada hidrófila. Los procedimientos divulgados en estas referencias de patentes se caracterizan por evitar la hemolisis. Esto es debido a que la hemolisis colorea de rojo la membrana entera de revelado inmunocromatogrático, incluyendo una zona para enjuiciamiento, y como un resultado de ello el enjuiciamiento se vuelve muy difícil.

Shiff (Trans. R. Soc. Trop. Med. Hyg., vol. 87, (nº. 6), págs. 646-8, (1993)), divulga la detección inmunocromatográfica de una proteína marcadora para Plasmodium faiciparum en la sangre de pacientes infectados. En ella, se usa un ensayo denominado ensayo ParaSight®-F y se usa el detergente anfolítico Zwittergent® 3-14 para hemolizar de la sangre antes de la detección inmunocromatográfica.

En campos distintos del procedimiento inmunocromatográfico, son conocidos un procedimiento de medición hemolítico [referencia de patente 4] o un reactivo para hemolizar la sangre entera con un detergente o similar (Celltac Chemi; Nihon Kohden Corporation). Estos sistemas de ensayo conocidos no tienen dicho problema, dado que los pigmentos rojos no afectan la medición.

Sin embargo, en reactivos para inmunocromatografía, en los cuales se usan un agente de revelado o de coloración y se realiza un juicio visual, tal como una inmunocromatografía de coloide de oro caracterizada por el teñido con rojo, el teñido con pigmentos rojos causados por la hemolisis es un problema crucial. Con el fin de evitar la hemolisis o un reventamiento de eritrocitos, las células de sangre se mantienen en el relleno para la separación del plasma bajo condiciones suaves y, de esta forma, transcurre algún tiempo antes de que comience el revelado inmunocromatográfico. Además, una cantidad del plasma revelado está afectado por la viscosidad de una muestra de sangre entera y, en consecuencia, frecuentemente se pierde cuantitividad. Además, frecuentemente existen cambios importantes de velocidad de separación y elución del plasma, dependiendo de la influencia de la matriz, tal como la viscosidad de una muestra de sangre entera. Por esta razón, existe disponible un aparato (Roche), en el cual se compensa una intensidad de color en base a un tiempo de revelado a partir de la separación del plasma por el relleno para colorear la separación del plasma (no a partir del suministro de una muestra de sangre entera).

Además, es técnicamente difícil mantener completamente las células de sangre sobre el relleno para la separación del plasma durante un tiempo largo, y algunas células de sangre alcanzan la membrana de revelado inmunocromatográfico. En un caso, tal como una inmunocromatografía de enzima, en el cual debería revelarse además una segunda solución de revelado, tal como una solución de lavado o una solución de substrato de enzima, después del revelado inmunocromatográfico de una muestra, las células de sangre que se escapan fuera del relleno para la separación del plasma y alcanzan la membrana de revelado inmunocromatográfico, inhiben un revelado de la segunda solución. Como un resultado de ello, no puede obtenerse un valor medido exacto mediante una inmunocromatografía de este tipo.

Además, como un caso especial, se conoce un reactivo [referencia de patente 5] para la medición de un antígeno sobre la superficie de eritrocitos mediante inmunocromatografía. En el ensayo, se usa una membrana de revelado inmunocromatográfico que tiene un tamaño de poro extremadamente grande (5 a 100 µm), y se lleva a cabo una etapa de revelado sobre la membrana sin un reventamiento de los eritrocitos. El ensayo se caracteriza porque los eritrocitos no revientan, así como por los procedimientos inmunocromatográficos convencionales anteriormente mencionados.

Las características importantes de un procedimiento inmunocromatográfico son conveniencia, rapidez, y bajo coste. Dichas ventajas se pierden en los procedimientos anteriores que usan una centrífuga, los cuales precisan tiempo y esfuerzo, o el uso de un filtro previo costoso para la separación del plasma. El problema se supera en los procedimientos anteriores en los cuales el relleno para la separación del plasma está localizado sobre la tira inmunocromatográfica, pero la rapidez o reproducibilidad de la misma debería mejorarse. Además, es difícil usar el relleno en un caso (por ejemplo, una inmunocromatografía de enzima) en el cual debería revelarse otro líquido después del revelado de una muestra a ensayar.

[referencia de patente 1] Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) No. 2002-214236.

[referencia de patente 2] Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) No. 2002-350428.

[referencia de patente 3] Patente Japonesa No. 2940990.

[referencia de patente 4] Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) No. 10-221334.

[referencia de patente 5] Publicación de Patente No Examinada Japonesa (Kokai) No. 2000-111555.

Descripción de la invención

Tal como se ha descrito anteriormente, en los procedimientos inmunocromatográficos convencionales que usan sangre (es decir, sangre entera) como una muestra, la muestra de sangre entera se trata previamente para llevar a cabo una separación suero/plasma, o bien existe localizado sobre la tira inmunocromatográfica un relleno para la separación del plasma con el fin de retardar el revelado de las células de sangre sobre la membrana de revelado inmunocromatográfico. Ambos procedimientos se caracterizan por no reventarse los eritrocitos en la sangre entera y no perderse pigmentos rojos procedentes de los eritrocitos. Sin embargo, la separación previa del suero/plasma tiene una desventaja en coste y esfuerzos. El procedimiento que usa el relleno de separación de plasma sobre la tira inmunocromatográfica tiene un problema con una reproducibilidad de un tiempo de medición o similar, debido a la viscosidad de la sangre...

1. Un procedimiento inmunocromatográfico caracterizado por comprender las etapas de:

(1) preparación de una muestra obtenida a partir de sangre entera mediante hemolisis de la sangre entera y un tratamiento para posibilitar el revelado cromatográfico,

(2) revelado de la muestra resultante sobre una membrana de revelado para inmunocromatografía, y

(3) revelado de un líquido de lavado sobre la membrana de revelado para inmunocromatografía, con el fin de separar, de esta forma, un pigmento rojo obtenido del eritrocito de la membrana de revelado para inmunocromatografía,

en el que la muestra obtenida a partir de sangre entera se prepara poniendo en contacto la sangre entera con un detergente no iónico, con el fin de hemolizar la sangre entera y solubilizar un componente contenido en la sangre entera, teniendo dicho componente un tamaño de partícula mayor que un tamaño de poro de la membrana de revelado para inmunocromatografía.

2. Un kit para inmunocromatografía caracterizado porque comprende

(1) una tira para inmunocromatografía y

(2) un líquido de dilución para la sangre entera que contiene un detergente no iónico,

en el que el líquido de dilución contiene el detergente iónico a una concentración tal que cuando la sangre entera se diluye con el líquido de dilución para preparar una muestra para inmunocromatografía, se hemoliza la sangre total.