PROCEDIMIENTO PARA LA IDENTIFICACIÓN DE LOS MODULADORES DE LA ACTIVIDAD DE LOS RECEPTORES DE CANALES IÓNICOS.

Procedimiento para la identificación de los moduladores de la actividad de los receptores de canales iónicos. La presente invención se refiere a un procedimiento para seleccionar o identificar un compuesto que puede modular la actividad de un receptor con canales iónicos, tal como un receptor GABA, midiendo el aflujo de calcio a través del receptor P2X en presencia de su agonista ATP cuando se acopla a dicho receptor con canales iónicos en células que expresan conjuntamente de forma recombinante estos dos receptores. La invención se refiere además a un kit o a un dispositivo que contiene elementos esenciales para llevar a cabo el procedimiento según la invención. Por último, la presente invención se refiere a la utilización de dichos compuestos seleccionados para la prevención o el tratamiento de enfermedades relacionadas con dicha disfunción del receptor con canales iónicos. Los receptores ácido gamma-aminobutírico (GABA) son glucoproteínas intrínsecas de la membrana en tejidos neuronales de mamífero que son miembros de la superfamilia de receptores con canal iónico regulados por ligando (denominados receptores con canales iónicos en la presente descripción). Los receptores GABA ejercen una función principal en la inhibición de la actividad neuronal del sistema nervioso central (SNC) debido a la distribución extendida de neuronas que liberan GABA y receptoras de GABA. Los receptores GABA pueden dividirse en dos clases principales: los subtipos de receptor GABA-A y GABA-C, y los tipos de receptor GABA-B, que se distinguen por las diferencias en los mecanismos efectores y en la farmacología. Los receptores GABA-A y GABA-C son canales de cloruro accionados por transmisores que son activados por GABA para abrir su canal de cloruro. Los canales del receptor GABA, proteínas que están presentes en la superficie de las neuronas, son los principales receptores inhibidores del sistema nervioso central y se componen de cinco subunidades que se ensamblan para formar un canal, que es permeable a los aniones, principalmente los iones cloruro. Existen 6 subunidades alfa, 3 subunidades beta, 3 gamma, 1 épsilon, 1 delta, 1 pi y 3 subunidades rho. Se cree que la mayoría de los receptores GABA-A se forman por asociación de 2 subunidades alfa, 2 beta y 1 gamma, si bien son posibles otras combinaciones. Todas estas combinaciones dan como resultado receptores con diferentes propiedades. Todas estas subunidades presentan una configuración similar, con un gran dominio extracelular, 4 dominios transmembranarios y un dominio intracelular mayor que conecta los dominios transmembranarios M3 y M4. Las corrientes eléctricas producidas por los movimientos de los iones a través de estos complejos receptores con canales de iones son bajas y no permiten la utilización directa de sonda fluorescente para cuantificar este aflujo de iones cloruro a las células. El procedimiento y el dispositivo que permiten los registros electrofisiológicos de estas corrientes son complejos. Por ejemplo, es necesario además imponer un voltaje constante y actuar en una sola célula. Entonces, este procedimiento que utiliza registros electrofisiológicos no puede utilizarse para realizar la identificación primaria de compuestos que pueden modular dichos canales receptores, compuesto que podría ser de gran interés en el campo farmacéutico. Los receptores P2X son canales iónicos cerrados al ligando mientras que los demás receptor P2, receptores P2Y, actúan generalmente a través de un sistema acoplado a la proteína G. Varios subtipos (P2X1-P2X7) de receptor P2X forman canales homómeros o heterómeros que son permeables a los cationes, incluyendo el calcio y que están específicamente activados por ATP extracelular, su agonista. Este receptor funciona como canal iónico cerrado al ligando con permeabilidad relativamente elevada al calcio (Egan et al., Neurosciences, 24(13):3413-3420, 2004). Los receptores P2X median en la despolarización de la membrana y en el aflujo de Ca ++ y tienen una función fisiológica que comprende desde la transmisión sináptica excitante rápida, la recepción del dolor a la vasoconstricción de vasos. Mediante los receptores P2X, ATP actúa como neurotransmisor excitador en el sistema nervioso central y periférico. Utilizando los registros electrofisiológicos (es decir midiendo las corrientes resultantes del paso de iones a través de los canales abiertos), se ha demostrado ya que los receptores GABA y los receptores P2X están funcional y físicamente acoplados cuando se expresan conjuntamente en un sistema de expresión heterólogo (ovocitos de Xenopus, células transfectadas de mamífero o neuronas que expresan ambas familia de receptores) (Boué-Grabot et al., Journal of Biological Chemistry, 279: 6967-6975, 2004; Boué-Grabot et al., Journal of Biological Chemistry, 279: 52519-52525, 2004). Puede asimismo mencionarse el documento de Sokolova et al. (J. of Neurosci. 2001, 21(14): 4958-68) que da a conocer la inhibición dependiente de la interacción entre los receptores P2x3 y GABA (A) expresados en las neuronas de los ganglios de la espina dorsal de rata por un método de electrofisiología. Se ha demostrado también que P2X interactúa también con los receptores nicotínicos de acetilcolina y los receptores de 5-HT3. 2 Entonces, resulta deseable proporcionar un procedimiento eficaz, no costoso y fácil de llevar a cabo, que puede utilizarse por detección de alto rendimiento, para seleccionar el compuesto que puede modular la actividad del receptor de canales iónicos tal como el receptor GABA. Este es el objetivo de la presente invención. Sorprendentemente, se ha demostrado que la activación de los receptores BABA-A reduce directamente el aflujo de calcio mediante los receptores P2X abiertos, medida utilizando una sonda de calcio fluorescente. Se ha observado también por registros electrofisiológicos que: cuando ATP y GABA se aplican conjuntamente, la corriente observada es inferior a la suma de las corrientes individuales, lo que demuestra que los dos receptores presentan inhibición recíproca cuando se activan conjuntamente. Esta inhibición funcional se basa en el acoplamiento molecular de los receptores en sus respectivos dominios intracelulares. Se ha observado también que las proteínas de cada receptor no se alteran por la presencia del otro tipo de receptor. De este modo, la presencia del receptor P2X no modifica las propiedades del receptor GABA con respecto a su agonista (GABA). La presencia del receptor GABA no modifica las propiedades del receptor P2X con respecto a su agonista (ATP). Solamente la amplitud de la respuesta de cada receptor disminuye cuando se activan simultáneamente. todos los receptores GABA (GABA-A, independientemente de su composición molecular y GABA-C) inhiben los receptores P2X2, tal como P2X en activación conjunta; las respuestas de los receptores P2X2 a ATP son estables durante la aplicación (no se insensibilizan) y a lo largo del tiempo (buena recuperación). Pueden utilizarse para analizar muchos compuestos rápidamente utilizando una sola célula ; y los receptores P2X activados por ATP median en un aflujo notable de calcio en una célula mantenida en su reposo potencial. Por lo tanto, expresando conjuntamente los receptores GABA y P2X en un modelo celular, la activación de los receptores GABA procederá a la modificación de la intensidad de fluorescencia de la respuesta de los receptores P2X provocada por ATP, o cualquier otro de los agonistas P2X bien conocidos. Así que, en un primer aspecto, la presente invención se refiere a un procedimiento para seleccionar o identificar un compuesto que puede modular la actividad de un receptor de canales iónicos, en el dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: a) presentar las células recombinantes que expresan de manera recombinante dicho receptor de canales iónicos y un receptor P2X; b) poner en contacto dichas células recombinantes con el compuesto que va a analizarse en presencia de un agonista de dicho receptor P2X, preferentemente tal como ATP, o en presencia de un agonista de dicho receptor P2X y el agonista de dicho receptor de canales iónicos; c) medir el aflujo de calcio mediante el receptor P2X; ES 2 365 790 T3 d) comparar la medida obtenida en la etapa c) con la medida obtenida en las mismas condiciones para un primer control de referencia en el que en la etapa b) el compuesto que va a analizarse no está presente; y e) seleccionar o identificar dicho compuesto como un compuesto que puede modular la actividad de un receptor de canales iónicos, si la comparación en la etapa d) demuestra un aumento o disminución significativas del aflujo de calcio en las células recombinantes en presencia de dicho compuesto. Si no se conoce inicialmente la estructura del compuesto analizado o seleccionado, su estructura podría identificarse por los procedimientos de identificación... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para seleccionar o identificar un compuesto que puede modular la actividad de un receptor de canales iónicos, en el que dicho procedimiento comprende las etapas siguientes: a) presentar las células que expresan conjuntamente de manera recombinante dicho receptor de canales iónicos y un receptor P2X; b) poner en contacto dichas células recombinantes con el compuesto que va a analizarse en presencia de un agonista de dicho receptor P2X, o en presencia de un agonista de dicho receptor P2X y el agonista de dicho receptor de canales iónicos; c) medir el aflujo de calcio mediante el receptor P2X, y en el que el aflujo de calcio se mide con una sonda de calcio; d) comparar la medida obtenida en la etapa c) con la medida obtenida en las mismas condiciones para un primer control de referencia en el que en la etapa b) el compuesto que va a analizarse no está presente; y e) seleccionar dicho compuesto si la comparación en la etapa d) demuestra un aumento o disminución de manera significativa del aflujo de calcio en las células recombinantes en presencia de dicho compuesto. 2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en la etapa c) el aflujo de calcio se mide mediante una sonda de calcio fluorescente. 3. Procedimiento según la reivindicación 1 ó 2, en el que en la etapa c) el aflujo de calcio se mide mediante una sonda fluorescente de calcio, verde de calcio, Fluo-3 o Fluo-4. 4. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que en la etapa a) dichas células recombinantes no expresan endógenamente un receptor que puede ser modulado por dicho agonista de dicho receptor P2X o por el agonista de dicho receptor de canales iónicos. 5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, en el que dichas células recombinantes en la etapa a) son células de mamífero u ovocitos de Xenopus. 6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, en el que dicho receptor P2X es un receptor P2X natural o un receptor P2X mutado que puede interactuar con dicho receptor de canales iónicos. 7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que dicho receptor P2X se selecciona de entre el grupo constituido por el receptor P2X1, P2X2, P2X3, P2X4, P2X5, P2X6 o P2X7 o cualquier receptor P2X que resulte de la asociación o la combinación de subunidades de receptor P2X que pueden ejercer una función de receptor de canal activado por ATP. 8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho receptor de canales iónicos o dicho receptor P2X es de origen humano, de rata o de ratón. 9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho agonista de dicho receptor P2 se selecciona de entre el grupo constituido por ATP, ,ß mATP (alfabeta-metileno ATP), benzoilbenzoico ATP (tal como los isómeros 2' y 3' mezclados o 2',3'-O-(4-benzoilbenzoil)-ATP (BzATP)) o 2-metiltio-ATP (2-MeSATP), preferentemente ATP. 10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, en el que dicho compuesto que va a analizarse se analiza por su capacidad para interactuar específicamente con dicho receptor P2X, demostrándose preferentemente dicha interactuación específica midiendo si se obtiene un aumento o una disminución significativos del aflujo de calcio en las mismas condiciones para un segundo control de referencia en el que en la etapa a) las células recombinantes utilizadas para dicho segundo control de referencia expresan a dicho receptor P2X y no expresan a dicho receptor de canales iónicos. 11. Procedimiento según la reivindicación 10, en el que dicho compuesto que va a analizarse no se selecciona si se observa un aumento o una disminución significativos del aflujo de calcio en las células recombinantes para dicho segundo control de referencia. 12. Procedimiento para seleccionar o identificar un agonista de un receptor de canales iónicos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: A) seleccionar o identificar un compuesto que puede modular la actividad de dicho receptor de canales iónicos mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que en la etapa b) dichas células ES 2 365 790 T3 recombinantes se ponen en contacto con el compuesto que va a analizarse solamente en presencia de un agonista de dicho receptor P2X; y B) selección de dicho compuesto como un agonista si la comparación realizada en la etapa d) del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11 demuestra una disminución significativa del aflujo de calcio en las células recombinantes en presencia de dicho compuesto en comparación con los resultados obtenidos para el primer control de referencia. 13. Procedimiento para seleccionar un modulador positivo de un receptor de canales iónicos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: A) seleccionar o identificar un compuesto que puede modular la actividad de dicho receptor de canales iónicos mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que en la etapa b) dichas células recombinantes se ponen en contacto con el compuesto que va a analizarse en presencia de un agonista de dicho receptor P2X y el agonista de dicho receptor de canales iónicos; y B) la selección de dicho compuesto como un modulador positivo si la comparación realizada en la etapa d) del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11 demuestra una disminución significativa del aflujo de calcio en las células recombinantes en presencia de dicho compuesto en comparación con los resultados obtenidos en el primer control de referencia. 14. Procedimiento para seleccionar un modulador positivo de un receptor de canales iónicos según la reivindicación 13, en el que en la etapa b) del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11 en A) el agonista de dicho receptor de canales iónicos se utiliza a una concentración no saturada. 15. Procedimiento para seleccionar o identificar un modulador negativo, un inhibidor o un antagonista de un receptor de canales iónicos, comprendiendo dicho procedimiento las etapas siguientes: A) seleccionar un compuesto que puede modular la actividad de dicho receptor de canales iónicos mediante un procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11, en el que en la etapa b) dichas células recombinantes se ponen en contacto con el compuesto que va a analizarse en presencia de un agonista de dicho receptor P2X, y el agonista de dicho receptor de canales iónicos; y B) la selección de dicho compuesto como un modulador negativo si la comparación realizada en la etapa d) del procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 11 demuestra un aumento significativo del aflujo de calcio en las células recombinantes en presencia de dicho compuesto en comparación con los resultados obtenidos en el primer control de referencia. 16. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 15, en el que las mismas células recombinantes utilizadas para analizar un primer compuesto pueden utilizarse para analizar por lo menos un segundo compuesto que ha de analizarse. 17. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 16, en el que dicho receptor de canales iónicos se selecciona de entre el grupo constituido por el receptor GABA, el receptor glicina, el receptor acetilcolina o el receptor serotonina. 18. Procedimiento según la reivindicación 17, en el que dicho receptor de canales iónicos es el receptor GABA. 19. Procedimiento según las reivindicaciones 17 ó 18, en el que dicho receptor de canales iónicos es un receptor GABA de canales iónicos resultante de la asociación homomérica o heteromérica entre cualquier subunidad del receptor GABA, seleccionándose dicha subunidad de entre el grupo de la subunidad del receptor GABA constituido por 1 a 6 subunidades de alfa, 1 a 3 de beta, 1 a 3 de gamma, 1 a 3 subunidades de delta, épsilon, theta, pi y rho, y formando dicha asociación homomérica o heteromérica un receptor de canales iónicos que puede ser activado por GABA. 20. Procedimiento según las reivindicaciones 18 ó 19, en el que el agonista de dicho receptor de canales iónicos es el GABA o cualquier otro agonista del receptor GABA bien conocido, tal como el muscimol o la isoguvacina. 21. Kit para la selección de un compuesto que puede modular la actividad de un receptor de canales iónicos, en el que dicho kit comprende: - las células que expresan conjuntamente de manera recombinante un receptor de canales iónicos y un receptor P2X; - un agonista del receptor P2X seleccionado de entre el grupo constituido por ATP, ,ß mATP (alfabeta-metileno ATP), benzoilbenzoico ATP (tal como los isómeros 2' y 3' mezclados o 2',3'-O-(4-benzoilbenzoil)-ATP (BzATP)) o 11 2-metiltio-ATP (2-MeSATP), preferentemente ATP; y ES 2 365 790 T3 - una sonda de calcio como un marcador para medir el aflujo de calcio en dichas células recombinantes. 5 22. Kit según la reivindicación 21, en el que dicha sonda de calcio es una sonda de calcio fluorescente. 23. Kit según la reivindicación 21 ó 22, en el que dicho kit comprende además un agonista de dicho receptor de canales iónicos. 10 24. Kit según la reivindicación 23, en el que dicho agonista de dicho receptor de canales iónicos es el GABA. 25. Kit según las reivindicaciones 21 a 24, en el que dicho receptor de canales iónicos, el receptor P2X, las células recombinantes y la sonda de calcio se seleccionan independientemente de entre los definidos en las reivindicaciones 1 a 20. 12 ES 2 365 790 T3 13 ES 2 365 790 T3 14 ES 2 365 790 T3 ES 2 365 790 T3 16