Un procedimiento para detectar un fragmento de ácido nucleico diana directamente en un espécimen obtenido de un paciente por hibridación in situ que comprende las etapas:

a) depositar una muestra del espécimen sobre un porta;

b) fijar la muestra al porta con un fijador que comprende metanol y ácido acético en una proporción de 99:1 a 80:20.

c) poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra fijada con una sonda de ácido nucleico marcada específica para el fragmento de ácido nucleico diana, en condiciones apropiadas para la hibridación;

d) eliminar por enjuague la sonda de ácido nucleico marcada no hibridada de la muestra;

e) teñir la muestra enjuagada con azul de Evans; y

f) detectar visualmente el complejo de la sonda hibridado mediante microscopia, siendo la presencia del complejo de la sonda una indicación de la presencia del fragmento de ácido nucleico diana

Procedimiento de hibridación in situ para detectar un ácido nucleico diana.

Antecedentes de la invención

Tradicionalmente se entiende por hibridación el procedimiento por el que, en condiciones de reacción predeterminadas, dos hebras parcial o completamente complementarias de moléculas de ácido desoxirribonucleico (ADN), moléculas de ácido ribonucleico (ARN), y combinaciones de ADN y ARN, se separan en hebras monocatenarias y después se dejan hibridar formando hélices dobles de bases pareadas. El término hibridación in situ, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una técnica de hibridación que de forma eficaz detecta las secuencias específicas de ácido nucleico en células o tejidos intactos. La técnica de hibridación in situ presenta la ventaja añadida de que también proporciona información morfológica sobre las células intactas individuales.

La técnica de hibridación in situ fue descrita por vez primera por Gall y Padre (Proc. Nat. Acad Sciences 63: 378-83 (1969)) y Jone et al. (Nature 225: 946-8 (1969)). Ambos grupos estudiaron la formación y detección de híbridos de ARN-ADN en preparaciones citológicas usando sondas radiomarcadas. La técnica permite la detección de ADN o ARN en células individuales que contienen secuencias específicas, en una población de células heterogénea. También permite la determinación simultánea de características bioquímicas y morfológicas de las células examinadas. Desde su descripción inicial, la hibridación in situ ha sufrido una evolución continua en su metodología y aplicación. Actualmente, la técnica tiene aplicaciones directas en muchas áreas de la investigación biomédica y clínica que incluyen la biología celular, el diagnóstico clínico, la biología del desarrollo, la genética y la virología.

En J Cell Science, 104, 1187-1197 (1993) (Dirks et al) se desvelan metodologías para la localización de intrones y exones específicos de ARN en células cultivadas mediante sondas haptenizadas y fluorocromizadas.

El documento US-A-5449604 desvela marcadores genéticos y ensayos para el cromosoma 14 y la enfermedad de Alzheimer familiar.

El documento US-A-5264343 desvela un procedimiento para distinguir células normales y cancerosas.

En Cytogenet Cell Genet 41:181-184 (1986) (Korthof) se desvela un procedimiento de fijación mejorado para la preparación de cromosomas de líneas celulares de hámster chino, híbridas de hámster chino y humanas y murinas.

J Clinical Microbiology, Nov 1996, p 2791-2794 (Krause et al) desvela la comparación por PCR con frotis de sangre e inoculación de animales pequeños para el diagnóstico de parasitemia por Babesia microti.

El documento US-A-5629147 desvela el enriquecimiento e identificación de células fetales en sangre materna mediante la hibridación in situ.

El documento WO-A-9002173 desvela un ensayo de hibridación in situ en una etapa.

Sumario de la invención

Un aspecto de la presente invención es un procedimiento para detectar un fragmento de ácido nucleico diana directamente en un espécimen obtenido de un paciente por hibridación in situ. El procedimiento comprende varias etapas que se realizan en el orden que se enumeran. Se deposita una muestra del espécimen sobre un porta. La muestra se fija al porta con un fijador que comprende metanol y ácido acético en una proporción de 99:1 a 80:20. Los ácidos nucleicos de la muestra fijada se ponen en contacto con un complejo de la sonda específica para el fragmento de ácido nucleico diana, en condiciones apropiadas para la hibridación. El complejo de la sonda no hibridado se elimina de la muestra por enjuague. La muestra enjuagada se tiñe con azul de Evans. El complejo de la sonda hibridado se detecta visualmente mediante microscopia, y la presencia del complejo de la sonda indica la presencia del fragmento de ácido nucleico diana. Las diferentes realizaciones incluyen el uso del procedimiento con diferentes tampones de hibridación. En una realización, se usa el tampón de hibridación que está constituido esencialmente por de 10% a 50% de formamida, 2 X SSC (pH 7,4), 1% de NP40. En otra realización, se usa el tampón de hibridación que está constituido esencialmente por GuSCN 1,5 M a 4 M. En otra realización, se usa el tampón de hibridación que está constituido esencialmente por GuHCl 2 M a 6 M. Otras realizaciones de la invención suponen el uso de sondas específicas para la identificación de patógenos de la especie Babesia, en una muestra. Otras realizaciones incluyen detectar ácidos nucleicos de una amplia variedad de especímenes, que incluyen suero, plasma, esputo, orina, líquido cefalorraquideo, tejido, leche materna e insectos como por ejemplo garrapatas.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se basa en el descubrimiento de un procedimiento mejorado para detectar directamente la presencia de un ácido nucleico diana en células de especímenes obtenidos de un paciente (por ejemplo frotis de sangre, tejidos incluidos en parafina y garrapatas), mediante hibridación in situ. El procedimiento de la invención está particularmente bien adaptado a la detección de secuencias de nucleótidos específicas de patógenos, que se encuentran en el interior de células hemáticas enteras o en tejidos infectados, usando sondas de oligonucleótidos, soluciones de fijación previa a la hibridación, soluciones de fijación posterior a la hibridación y protocolos especiales. Más específicamente, se describen mejoras novedosas de los tradicionales procedimientos de fijación/pretratamiento que emplean compuestos orgánicos e inorgánicos que permiten selectivamente que las sondas de oligonucleótidos penetren en los patógenos, tanto bacterianos como protozoarios, que están localizados en el interior de las células infectadas. Además, un procedimiento posterior a la fijación con azul de Evans después de la hibridación con una sonda marcada por fluorescencia, permite visualizar fácilmente los organismos que albergan las sondas hibridadas en el interior de las células hemáticas.

La novedosa y única técnica de hibridación y detección in situ que se describe en el presente documento es un protocolo que permite usar las sondas de ADN o ARN recombinantes con células, microorganismos, o secciones de tejido, y es compatible con el examen microscópico que habitualmente se realiza en los laboratorios de bacteriología, parasitología, histología o patología. La presente invención aplica una sonda de ácido nucleico de una secuencia de nucleótidos predeterminada a las células (o tejido) y al examen de la muestra por microscopia para determinar qué células (o tejidos) de la población contienen las secuencias de ácido nucleico específicas de interés. Por lo tanto, en frotis de sangre entera o de cortes de tejidos infectados, pueden detectarse organismos patógenos como por ejemplo bacterias, virus, protozoos u hongos, dentro de las células infectadas. Dichos protocolos proporcionan una información útil científica y de diagnóstico dado que la presencia o ausencia de un ácido nucleico específico puede correlacionarse directa o indirectamente con una o más células de estructura y morfología observable y, de ese modo, constituyen una base para el diagnóstico y pronóstico clínicos.

El procedimiento para detectar un fragmento de ácido nucleico diana directamente a partir de un espécimen está compuesto por múltiples etapas que pueden realizarse en el orden específico que se enumera. Un espécimen, habitualmente obtenido de un paciente, se deposita primero sobre un porta. La muestra se fija sobre el porta con fijador. El fijador comprende metanol y ácido acético en una proporción de aproximadamente 99:1 a 80:20. Una vez se ha fijado la muestra, los ácidos nucleicos de la muestra fijada se ponen en contacto con un complejo de la sonda específica para el fragmento de ácido nucleico diana, en condiciones apropiadas para la hibridación. El complejo de la sonda está formado por una secuencia de ácido nucleico que es lo suficientemente complementaria al ácido nucleico diana para hibridarse con el ácido nucleico diana en condiciones restrictivas. El complejo de la sonda también se derivó con un resto que sirve de marcador para la presencia de la sonda. Después de un periodo adecuado de hibridación, la sonda no hibridada se elimina de la muestra por enjuague. La muestra después se enjuaga con azul de Evans para conseguir una tinción de contraste de las células huésped y observar con claridad la(s)...

1. Un procedimiento para detectar un fragmento de ácido nucleico diana directamente en un espécimen obtenido de un paciente por hibridación in situ que comprende las etapas:

a) depositar una muestra del espécimen sobre un porta;

b) fijar la muestra al porta con un fijador que comprende metanol y ácido acético en una proporción de 99:1 a 80:20.

c) poner en contacto los ácidos nucleicos de la muestra fijada con una sonda de ácido nucleico marcada específica para el fragmento de ácido nucleico diana, en condiciones apropiadas para la hibridación;

d) eliminar por enjuague la sonda de ácido nucleico marcada no hibridada de la muestra;

e) teñir la muestra enjuagada con azul de Evans; y

f) detectar visualmente el complejo de la sonda hibridado mediante microscopia, siendo la presencia del complejo de la sonda una indicación de la presencia del fragmento de ácido nucleico diana.

2. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el fijador es metanol y ácido acético en una proporción de 95: 5 a 99: 1.

3. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que

(a) la sonda de ácido nucleico marcada se pone en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un tampón que está formado esencialmente entre 10% y 50% de formamida, 2 X SSC (pH 7,4), 1% de NP40; o

(b) la sonda de ácido nucleico marcada se pone en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un tampón que está formado esencialmente por tampón de GuSCN de 1,5 M a 4 M; o

(c) la sonda de ácido nucleico marcada se pone en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un tampón que está formado esencialmente por tampón de GuHCl de 2 M a 6 M; o

(d) la sonda de ácido nucleico marcada comprende un oligonucleótido ligado a un marcador fluorescente.

4. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que la sonda de ácido nucleico marcada comprende un ácido nucleico ligado a biotina.

5. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el ácido nucleico diana es específico para un patógeno con el que presuntamente está infectado el paciente, y opcionalmente, en el que el patógeno es B. microti y el complejo de la sonda es 5'-Fluoresceína-GCCACGCGAAAACGCGCCTCGA-Fluoresceína-3'.

6. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que

(a) la sonda de ácido nucleico marcada se pone en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un tampón que está formado esencialmente por GuSCN 2,5 M, Tris 50 mM (pH 7,8), EDTA 20 mM y 1% de NP40 a 37ºC, o

(b) la sonda de ácido nucleico marcada se pone en contacto con los ácidos nucleicos de la muestra fijada en un tampón que está formado esencialmente por 50% de formamida, 2 X SSC (pH 7,4), EDTA 20 mM, 1% de NP40 a 42ºC.

7. El procedimiento de la reivindicación 3, en el que la sonda de ácido nucleico marcada comprende una pluralidad de diferentes secuencias de ácido nucleico, cada una marcada con un marcador fluorescente diferente.

8. El procedimiento de la reivindicación 5, en el que el patógeno es Babesia y el complejo de la sonda comprende uno o más de los siguientes oligonucleótidos o sus complementos:

9. El procedimiento de la reivindicación 8, en el que

(a) el patógeno es B. microti y la sonda de ácido nucleico marcada comprende uno o más de los siguientes oligonucleótidos o sus complementos:

(b) el patógeno es B. WA-1 y el complejo de la sonda comprende 5'-AATAAACGCAGCCAAGAC-3' (SEC. ID. N.º: 5).

10. El procedimiento de la reivindicación 1, en el que el espécimen es cualquiera de sangre entera, suero, plasma, esputo, orina, líquido cefalorraquídeo, tejido y leche materna; o se obtiene de una garrapata.