Un procedimiento para estimar in vitro la cantidad de células específicas en una muestra de un paciente,

en el que se usan moléculas con especificidad celular para calcular el número de células específicas, que comprende

a) extraer una alícuota de dicha muestra; y

b) medir la concentración de dos moléculas con especificidad celular en dicha muestra extraída por medio de un ensayo inmunológico y determinar la relación entre las concentraciones de dichas moléculas,

en el que las moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos

Procedimiento para estimar la cantidad de tipos celulares de neutrófilos específicos.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a la estimación de la cantidad de subtipos de células específicas, por ejemplo el número de ciertos subtipos de leucocitos, por medio de mediciones de proteínas únicas en extractos de sangre y otro material biológico. El conocimiento del número o cantidad de subtipos específicos de glóbulos blancos es importante en el diagnóstico clínico y la vigilancia de sujetos con enfermedades inflamatorias entre las que se incluyen enfermedad infecciosa, cáncer, alergia/asma, etc.

Antecedentes de la invención

La estimación del número de diversos leucocitos en la sangre y en otros fluidos corporales es una de las herramientas usadas más ampliamente en medicina. La forma tradicional de obtener esta información es el recuento y diferenciación de las células con un microscopio óptico. Esta técnica se complementa por el recuento automático en contadores de células basados en el principio de recuento del número de partículas en el fluido y la medición de diversos parámetros físicos tales como el tamaño y la dispersión hacia delante y lateral, pero también por tinción histoquímica de células. Una extensión de estas técnicas es el principio del citómetro de flujo en el que se usan anticuerpos para identificar células individuales basándose en sus antígenos de la superficie celular o por medio de su contenido de antígenos intracelulares después de la permeabilización de las células.

En el documento WO 00/58726 se describe un procedimiento para cuantificar la cantidad de leucocitos en sangre entera. Sin embargo, este procedimiento no cuantifica diferentes subtipos específicos de leucocitos respecto al número o relación.

Sumario de la invención

Existe la necesidad de ensayos fáciles de usar, baratos y fiables para estimar el número de diversos glóbulos blancos tales como neutrófilos y eosinófilos, en la sangre y en otros fluidos corporales, aplicables en el sitio de atención, ayudando de esta manera al médico en su toma de decisiones inmediata.

El presente inventor ha descubierto que la extracción de sangre entera con, por ejemplo, detergentes tales como CTAB (bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio) y la posterior medición por inmunoensayos específicos de las proteínas de neutrófilos MPO (micloperoxidasa), HNL (lipocalina de neutrófilos humanos) o lactoferrina, o las mediciones específicas de proteínas de eosinófilos tales como EPX (proteína x de eosinófilos) o EPO (peroxidasa de eosinófilos) identificarán de forma precisa el número de eosinófilos presentes en la sangre. La estimación del número de neutrófilos es útil en el diagnóstico y monitorización de sujetos con enfermedades inflamatorias tales como infecciones o enfermedades reumatoides, pero también junto con el tratamiento médico, en particular el tratamiento citostático, en el que puede producirse una reducción de la producción de neutrófilos, es decir, neutropenia como efecto adverso grave del tratamiento. La estimación del número de eosinófilos es útil en pacientes con enfermedad alérgica, enfermedades inflamatorias crónicas, enfermedades parasitarias y ciertos cánceres tales como la enfermedad de Hodking, pero también como un indicador general de enfermedad, ya que pueden aparecer números elevados de eosinófilos en varias enfermedades por razones desconocidas.

La invención se refiere a la estimación de poblaciones en diversas fases de maduración de células mieloides, ya que algunas proteínas intracelulares se producen principalmente por células inmaduras y otras proteínas principalmente por células más maduras.

De esta manera, la invención se refiere a un procedimiento para estimar in vitro la cantidad, refiriéndose la cantidad al número o relación de subtipos de células específicas en una muestra de un paciente, que comprende

en el que las moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos.

La muestra preferentemente es sangre u otro fluido corporal. Se extrae una cantidad muy pequeña de muestra, tal como 1-10 µl de muestra, pero podrían considerarse volúmenes mayores.

La extracción preferentemente se realiza con detergentes catiónicos. El tiempo de extracción es muy corto, por ejemplo, 1 minuto. Preferentemente, el detergente es CTAB.

Preferentemente, la medición en la etapa b) es por medio de un inmunoensayo, tal como ELISA, EIA, FEIA o RIA.

La molécula o moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos tales como MPO (mieloperoxidasa), HNL (lipocaína de neutrófilos humanos) o lactoferrina para medir neutrófilos.

Descripción detallada de la invención

La presente invención se describirá con más detalle a continuación en asociación con los dibujos adjuntos en los que

la Fig. 1 muestra una correlación entre el número de neutrófilos sanguíneos y la concentración de proteína MPO en sangre entera extraída con detergente.

La Fig. 2 muestra la relación entre MPO y lactoferrina en sangre entera extraída con detergente.

La Fig. 3 muestra una correlación entre el número de eosinófilos y la concentración de proteína EPO en sangre entera extraída con detergente.

Sección experimental

Aislamiento y purificación de proteínas de gránulos de eosinófilos y neutrófilos humanos

Se prepararon gránulos a partir de la capa leucocitaria de granulocitos obtenidos de donantes de sangre sanos usando una modificación del procedimiento descrito por Peterson y col. (Eur. J. Haematol. 40 (1988) 415-423). En resumen, los glóbulos rojos se dejaron sedimentar usando Dextrano T-500 antes de recoger el plasma rico en leucocitos. Los leucocitos se lavaron dos veces en Sacarosa 0,34 M y se suspendieron en 5 volúmenes de Sacarosa 0,34 M. Los leucocitos se cavitaron usando N₂ a una presión de 750 psi (5,17 MPa) durante 30 min a +4ºC (Klempner y col., J. Cell. Biol. 86 (1980) 21-28; y Borregaard y col., J. Cell. Biol. 97 (1983) 52-61). El cavitado se suspendió en Sacarosa 0,34 M y NaCl 0,17 M y se centrifugó durante 20 min a 450 xg a +4ºC.

Es sobrenadante se centrifugó durante 20 min a 10.000 xg a +4ºC para sedimentar los gránulos. A partir de los extractos de gránulos se purificó mieloperoxidasa (MPO) de acuerdo con Olsson y col. (Scand. J. Haematol. 9 (1972) 483-491) y Cooray y col. (Vet. Immunol. Immunopathol. 38 (1993) 261-272). La preparación final fue completamente homogénea de acuerdo con la relación de absorbancia A430 nm/A280 nm, que fue 0,80 (Agner Acta. Chem. Scand. 12 (1958) 89-94).

Se purificó lipocalina de neutrófilos humanos (HNL) como se describe (Xu y col., Scand J Clin Lab Invest 54 (1994) 365-376). La HNL se purificó hasta la homogeneidad de acuerdo con la electroforesis en SDS-PAGE y tinción con plata y el antígeno no reaccionaba con anticuerpos contra las otras proteínas de neutrófilos, MPO; Lactoferrina, Catepsina G, Elastasa y Lisozima. La Lactoferrina se purificó como se describe (Reiter Int. J. Tissue React. 5 (1983) 87-96). La Peroxidasa de Eosinófilos (EPO) se purificó como se describe (Carlson y col. J. Immunol. 134 (1985) 1875-1879) y la preparación final fue homogénea de acuerdo con la relación de absorbancia A415 nm/A280 nm, que fue 1,15. La proteína de eosinófilos (EPX) se purificó hasta la homogeneidad como se describe (Peterson y col., Immunol. 50 (1983) 19-26). La preparación final aparecía como una banda en la electroforesis SDS-PAGE y no reaccionaba con anticuerpos contra la proteína catiónica de eosinófilos (ECP), elastasa, catepsina G, MPO y EPO.

Producción de anticuerpos

Anticuerpos policlonales

Se indujeron anticuerpos contra MPO, HNL, EPO y EPX en conejos mediante inyecciones intracutáneas en múltiples sitios en conejos de 50-100 µg en total de las proteínas purificadas suspendidas en adyuvante completo e incompleto de Freund. La especificidad de los anticuerpos se evaluó por inmunodifusión doble (Ouchterlony Acta Pathol. Microbiol. Scand 26 (1949) 507-) en agarosa y se ensayó frente a extractos de gránulos de neutrófilos y eosinófilos y las siguientes...

1. Un procedimiento para estimar in vitro la cantidad de células específicas en una muestra de un paciente, en el que se usan moléculas con especificidad celular para calcular el número de células específicas, que comprende

en el que las moléculas con especificidad celular son proteínas de neutrófilos.

2. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la extracción se realiza con un detergente catiónico.

3. Un procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el detergente es CTAB (bromuro de N-cetil-N,N,N-trimetilamonio).

4. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que la muestra del paciente es sangre entera.

5. Un procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores, en el que las moléculas con especificidad celular son MPO (mieloperoxidasa), HNL (lipocalina de neutrófilos humanos) o lactoferrina.