Procedimiento para estabilizar la alfa-trombina en solución que contiene trombina.

Un procedimiento para estabilizar α-trombina en una solución que contiene trombina,

que comprende ajustar el porcentaje de α-trombina al 70 % o mayor con respecto a la cantidad de trombina total en la solución que contiene trombina.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/JP2007/001367.

Solicitante: Sekisui Medical Co., Ltd.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 13-5, Nihonbashi 3-chome Chuo-ku Tokyo 103-0027 JAPON.

Inventor/es: IKEDA,Remi, MORIKAWA,Chizuru, YAGO,Hirokazu.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C12N9/96 QUIMICA; METALURGIA.C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › Estabilización de una enzima por formación de un aducto o de una composición; Formación de conjugaciones de enzimas.
  • C12Q1/37 C12 […] › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › peptidasa o proteinasa.
  • G01N33/86 FISICA.G01 METROLOGIA; ENSAYOS.G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › en los que interviene el tiempo de coagulación de la sangre.

PDF original: ES-2382758_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Procedimiento para estabilizar la α-trombina en solución que contiene trombina

5 Campo de la técnica

La presente invención se refiere a un procedimiento para estabilizar la α-trombina inestable contenida en una solución que contiene trombina.

Técnica anterior

El fibrinógeno es un precursor de la fibrina, que es una proteína predominante que forma coágulos de sangre y se produce en las células parenquimatosas hepáticas. En el cuerpo humano, en el plasma hay aproximadamente un 80 % de fibrinógeno (p. ej., de aproximadamente 200 a 400 mg/dl en un adulto sano) y la cantidad restante está

presente en los tejidos. El fibrinógeno es una glicoproteína que contiene tres cadenas polipeptídicas apareadas (es decir, Aα, Bβ y γ) acopladas a través de un enlace disulfuro. Cuando las cadenas Aα y las cadenas Bβ se escinden del fibrinógeno mediante la trombina, se forma fibrina. La fibrina desempeña el papel principal en la formación de trombos y la hemostasia. Clínicamente, el fibrinógeno aumenta en condiciones de inflamación y disminuye en los trastornos hepáticos graves, CID etc.

El fibrinógeno se puede analizar mediante el método de Clauss (procedimiento de adición de trombina) , el procedimiento derivado de PT (procedimiento del tiempo de coagulación) , TIA (inmunoensayo turbidimétrico) , el procedimiento del látex etc. Entre ellos, con frecuencia se usa el procedimiento de adición de trombina. Específicamente, se añaden trombina y cloruro cálcico a una muestra de plasma a la que se ha añadido citrato sódico y se mide el tiempo de coagulación. La concentración de fibrinógeno (mg/dl) en la muestra se calcula mediante una curva de calibración obtenida a partir de los tiempos de coagulación a concentraciones conocidas de fibrinógeno.

Una trombina en el ensayo de fibrinógeno es α-trombina, que se produce mediante la escisión de un péptido de protrombina (es decir, precursor de la trombina) y exhibe actividad de coagulación. Se sabe que la α-trombina sufre autodescomposición para formar β-trombina o, además, para formar γ-trombina, que son trombinas de bajo peso molecular sin actividad de coagulación. Por tanto, en general, la α-trombina se liofiliza para almacenamiento a largo plazo.

Se han realizado varios intentos para estabilizar la trombina en una solución. Por ejemplo, se han conocido varios procedimientos, tales como: (1) un procedimiento en el que se añaden concentraciones altas de glicerol y poliol (p. ej., sacarosa, manitol, sorbitol etc.) a la trombina (Documento patente 1) ; y (2) un procedimiento en el que a la trombina se añaden sacáridos, aminoácidos etc. (Documento patente 2) . No obstante, estos procedimientos exhiben un efectos insatisfactorio de estabilizar la trombina en un ensayo/reactivo de fibrinógeno líquido.

Un procedimiento de estabilización conocido para la trombina contenida en un reactivo de ensayo de fibrinógeno incluye añadir un antagonista de trombina a una solución que contiene trombina (Documento patente 3) . No obstante, el mecanismo de este procedimiento se basa en la inhibición de la actividad de la trombina. Por tanto, cuando se usa este procedimiento, el tiempo de coagulación de una muestra de concentración baja de fibrinógeno, 45 que es una muestra importante en ensayo de fibrinógeno, se prolonga considerablemente y, en algunas ocasiones, no detectable. La prolongación del tiempo de coagulación produce reducción del rendimiento de la muestra y los fallos en el análisis de las muestras con concentración baja de fibrinógeno producen un incremento del número de muestras que se tienen que volver a analizar. Por tanto, el procedimiento anterior no es adecuado para un ensayo médico de urgencia.

En estas circunstancias, existe la necesidad de un procedimiento para estabilizar la α-trombina en una solución que contiene α-trombina, que se puede realizar en muestras de concentración baja de fibrinógeno sin producir una prolongación considerable del tiempo del ensayo y con pocos efectos sobre las mediciones, por lo que es aplicable a los reactivos de ensayo con fibrinógeno líquido.

55 Documento de patente 1: JP-A-1987-106028 Documento de patente 2: JP-A-1989-040433 Documento de patente 3: JP-A-2004-191367

Divulgación de la invención

Problemas que ha de resolver la invención

El objeto de la presente invención es proporcionar un procedimiento para estabilizar la α-trombina inestable 65 contenida en una solución que contiene trombina.

Medios para resolver los problemas

Los presentes inventores han llevado a cabo extensos estudios con el fin de alcanzar los objetos mencionados anteriormente y han descubierto que la β-trombina y la γ-trombina, anteriormente consideradas simples productos de autodescomposición de la α-trombina, tienen una actividad de descomposición de la α-trombina más fuerte que la actividad de autodescomposición de la α-trombina. Bastante sorprendentemente, los inventores también han descubierto que suprimiendo la (s) cantidad (es) de β-trombina y/o de γ-trombina con respecto a la cantidad de trombina total para que entre dentro de un cierto intervalo bajo, la α-trombina, previamente considerada inestable debido a la actividad de autodescomposición, se puede estabilizar en una solución que contiene α-trombina. La presente invención se ha conseguido sobre la base de estos hallazgos.

De acuerdo con esto, la presente invención proporciona un procedimiento para estabilizar la α-trombina en una solución que contiene trombina, que incluye ajustar el porcentaje de α-trombina al 70 % o más con respecto a la cantidad de trombina total en la solución que contiene trombina.

Efectos de la invención

De acuerdo con la presente invención, se puede evitar la disminución del porcentaje restante y la actividad de αtrombina en una solución que contiene trombina, de modo que se puede mejorar la estabilidad y la calidad de la solución que contiene trombina. Además, la invención puede mejorar la estabilidad y la calidad durante el almacenamiento de un reactivo de ensayo de fibrinógeno adecuado para ensayos médicos de urgencia.

Breve descripción de las figuras

[Fig. 1] Imágenes en SDS-PAGE al 10-20% de trombina purificada. La imagen de la izquierda corresponde a α-trombina purificada y la imagen de la derecha corresponde a una mezcla de β-y γ-trombinas. A indica una banda atribuida a la α-trombina y B indica una banda atribuida a las β-y γ-trombinas. [Fig. 2] Gráfico que muestra los porcentajes del contenido de α-trombina restantes tras un ensayo acelerado (37 ºC) , siendo el tiempo de coagulación la semana 0 del 100%. [Fig. 3] Gráfico que muestra la actividad de la trombina tras un ensayo acelerado (37 ºC) , siendo el tiempo de coagulación la semana 0 del 100%. [Fig. 4] Gráfico que muestra la prolongación del tiempo de coagulación observada en la muestra 1 tras un ensayo acelerado (37 ºC) , siendo el tiempo de coagulación la semana 0 del 100%. [Fig. 5] Gráfico que muestra la prolongación del tiempo de coagulación observada en la muestra 2 tras un ensayo acelerado (37 ºC) , siendo el tiempo de coagulación la semana 0 del 100%.

Mejores modos para llevar a cabo la invención

En la presente invención, el contenido en α-trombina con respecto a la cantidad de la trombina total en una solución que contiene trombina es del 70 % o superior, preferentemente del 80 % o superior, más preferentemente del 90 %

o superior. Todavía más preferentemente, el contenido en α-trombina es del 70 % o superior y el contenido en β-y/o γ-trombina es inferior al 30 %, todavía más preferentemente el contenido en α-trombina es del 80 % o superior y el contenido en β-y/o γ-trombina es inferior al 20 %, y, particularmente preferentemente, el contenido en α-trombina es del 90 % o superior y el contenido en β-y/o γ-trombina es inferior al 10 %, con respecto a la cantidad de trombina 45 total en una solución que contiene trombina.

En la presente invención, como se ha descrito en los siguientes Ejemplos de la presente invención, a medida que aumenta el contenido en β-y/o γ-trombina con respecto a la cantidad de la trombina total, los mayores niveles de βy/o γ-trombina reducen el porcentaje restante y la actividad de la α-trombina en una solución que contiene... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento para estabilizar α-trombina en una solución que contiene trombina, que comprende ajustar el porcentaje de α-trombina al 70 % o mayor con respecto a la cantidad de trombina total en la solución que contiene 5 trombina.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que el contenido en β-y/o γ-trombina con respecto a la cantidad de trombina total en la solución que contiene trombina es inferior al 30 %.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que la solución que contiene trombina tiene un pH de 4 a 9.


 

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