Se detalla un procedimiento de preparación, conservación y análisis de muestras de material vegetal y artrópodos para diagnóstico y detección mediante amplificación molecular basada en PCR a tiempo real.

El procedimiento se ha aplicado a la detección deCa. Liberibacter spp., agentes patógenos de la enfermedad del Huanglongbing de los cítricos, zebra chip de la patata y otras. Las muestras son inmovilizadas en soportes de papel o nylon mediante impresión de tejidos o escachado de artrópodos o absorbidas en papel o nylon cuando se trata de muestras líquidas. Las muestras inmovilizadas, pueden ser conservadas a temperatura ambiente. El protocolo de análisis comienza por la extracción de dianas del soporte con agua destilada, octoxinol o tampón glicina y posterior análisis por PCR a tiempo real. Se detallan las secuencias de nucleátidos de iniciadores para amplificación molecular en las que se basa el kit de detección.

Procedimiento directo de detección específica de Candidatus Liberibacter spp., mediante dianas inmovilizadas y PCR a tiempo real y kit para su detección.

Campo de la invención

La invención se relaciona en general con la detección de material genético (secuencias de ácidos nucleicos) mediante el empleo de la técnica de la reacción en cadena de la polimerasa a tiempo real, y en particular con la preparación previa de las muestras y su conservación, antes de realizar PCR cuantitativa a tiempo real. El procedimiento comprende la inmovilización directa, conservación y extracción de las dianas de interés para su amplificación molecular por PCR a tiempo real. La invención, por tanto, se relaciona con: 1) un procedimiento de preparación directa de muestras mediante inmovilización en membranas de papel o nylon por impresión o escachado de material vegetal o artrópodos, 2) un procedimiento para analizar extractos brutos de muestras de material vegetal o DNA purificado, inmovilizado en soportes sólidos, 3) un método de conservación de las membranas conteniendo muestras de cualquier tipo, 4) un sistema de extracción de dianas sin purificación de ácidos nucleicos y 5) unas secuencias de nucleótidos de iniciadores y sonda TaqMan específicos, para el diagnóstico y detección universal de Ca. Liberibacter spp., de cualquier origen, huésped o vector, mediante un kit basado en todo lo anterior.

Antecedentes de la invención

La patente ES 2 110 916 de 25 de mayo de 1996, de la cual fue solicitante el Instituto Valenciano de Investigaciones Agrarias (IVIA) e inventores Mariano Cambra Álvarez, Antonio Olmos Castelló y Miguel Ángel Dasi Rodríguez, describe un procedimiento de preparación de dianas para la reacción en cadena de la polimerasa (PCR) convencional. Esta patente ha sido mantenida por IVIA hasta la fecha. En la actualidad, se han realizado nuevas aplicaciones y modificado el procedimiento inicialmente descrito en la patente y posteriormente por Olmos et al., 1996 (Nucleic Acids Res. 24, 2192-2193), para simplificarlo y poderlo aplicar a agentes patógenos no ensayados todavía y muy problemáticos en su detección, como bacterias Gram negativas no cultivables in vitro (limitadas al floema o al xilema de plantas y a artrópodos).

El procedimiento de inmovilización de dianas en soportes sólidos (membranas), su extracción y análisis mediante PCR o RT-PCR a tiempo real, sólo se ha aplicado a la detección de virus en material vegetal y en artrópodos (Olmos et al., 2005. J. Virol. Methods 128, 151-155; Cambra et al., 2006. In: Virus Diseases and Crop Biosecurity, Ed. NATO-Security trough Science. Series C. Springer. 81-88 pp.; Osman y Rowhani, 2006. J. Virol. Methods 133, 130-136; Olmos et al., 2007. In: Biotechnology and plant diseases management. CABI Press, British Columbia. 227-249 pp.; Bertolini et al., 2008. Eur. J. Plant Pathol. 120, 177-188; López et al., 2009. Curr. Issues Mol. Biol. 11, 13-46; Capote et al. 2009. Int. Microbiol. 12, 1-6; Bertolini et al., 2010. Eur. J. Plant Pathol. 128, 283-287. El procedimiento no ha sido descrito para detección de bacterias restringidas al floema o xilema de plantas (sin fase epífita), en material vegetal ni en sus vectores. La detección fiable de estos organismos, algunos de ellos clasificados como de cuarentena, hace necesario el desarrollo de técnicas, protocolos y kits extremadamente sensibles y específicos para su detección y diagnóstico y que puedan ser empleados en gran escala de una forma sencilla. Además, la invención permite la conservación y el uso de controles inmovilizados sin riesgo de escapes.

Candidatus Liberibacter spp. está constituido, hasta ahora, por un grupo de seis especies: Ca. Liberibacter asiaticus, Ca. Liberibacter africanus, Ca. Liberibacter americanus, Ca. Liberibacter endosymbiont, Ca. Liberibacter solanacearum y Ca. Liberibacter europaeus (Bové. 2006. J. Plant Pathol. 88, 7-37; Liefting et al., 2009. Plant Dis. 93, 208-214; Raddadi et al., 2011. Environmental Microbiology 13(2), 414-426). Estas especies de bacterias Gram negativas, no son fácilmente cultivables en medios artificiales in vitro (Sechler et al., 2009. Phytopathology 99, 480-486), están restringidas al floema, son dispersadas naturalmente por diversas especies de psilas y por propagación vegetativa, y causan enfermedades con graves repercusiones económicas en cítricos, patata y plantas hortícolas (Bové. 2006; Secor et al., 2008. Am. J. Potato Res. 85; 29 Li et al., 2009. J. Microbiol. Methods 78, 59-65; Brown et al., 2010. Plant Disease 94, 376).

Las especies que afectan a los cítricos causan la enfermedad denominada Huanglongbing o HLB (Bové. 2006), también denominada "greening", que es actualmente la enfermedad más devastadora de los cítricos (Duran-Vila et al., 2009. Levante Agrícola 398, 348-355). La enfermedad bacteriana HLB afecta gravemente la producción de cítricos en varios países de Asia, África, América y Oceanía. La enfermedad no ha sido detectada en países de la UE, ni de la cuenca del Mediterráneo, donde se considera al agente causal como organismo de cuarentena, según la Directiva 2000/29/CE y otras en otros países. Ello obliga a notificar su detección y proceder a su erradicación, en caso de confirmarse la presencia de plantas infectadas, implicando serias restricciones internacionales al movimiento y comercio de material vegetal de cítricos para propagación.

HLB puede afectar a todas las especies y cultivares de cítricos (naranjos, mandarinos, pomelos, limas y limoneros, entre otros) injertados sobre cualquier patrón. El agente responsable de HLB ha sido caracterizado por métodos moleculares como tres especies "candidatas" (no cultivables in vitro) del género Liberibacter (Ca. Liberibacter africanus, asiaticus y americanus). El HLB africano está asociado a la especie Ca. L. africanus que es sensible al calor y está extendida por las regiones del sur y este de África y es trasmitida, en condiciones naturales, por la psila Trioza erytreae. El HLB asiático está asociado a la especie Ca. L. asiaticus que es más tolerante al calor y se transmite naturalmente mediante la psila Diaphorina citri. Esta forma de HLB está presente en Asia, Brasil, Florida (EEUU), y también en Oceanía. El HLB americano está asociado a dos especies, Ca. L. americanus y Ca. L. asiaticus, ambas transmitidas por la psila D. citri. Experimentalmente, cualquier especie de Liberibacter de los cítricos puede ser transmitida indistintamente por D. citri o por T. erytreae. Según los datos disponibles, las únicas zonas libres tanto de HLB como de sus vectores, son los países de la cuenca del Mediterráneo, Australia, Nueva Zelanda y algunas islas del Pacífico (Teixeira et al, 2008. Mol. Cell Probes 22, 139-150). Sin embargo, T. erytreae, vector de Ca. L. africanus, se encuentra ya en Madeira (Portugal) y en varias islas de Canarias, donde se ha confirmado su presencia desde 2002 (Pérez y Carnero, 2002. Granja 9:54-57; Duran-Vila et al., 2009). La presencia del vector hace que esta zona sea especialmente vulnerable a la introducción fortuita de las especies de Ca. Liberibacter causantes de HLB, que luego se dispersaría con relativa rapidez. Por tanto, resulta imprescindible realizar prospecciones periódicas intensivas y analizar las muestras tomadas en laboratorios especializados mediante técnicas sensibles y fiables.

En cultivos de plantas hortícolas y en solanáceas de cultivo extensivo como la patata, causa proliferaciones, distorsiones, enanismo, clorosis en la planta y necrosis en los haces vasculares de los tubérculos, dando lugar a enfermedades conocidas como "zebra chip" de la patata (Secor et al., 2008; Rehman et al. 2010. Plant Disease 94, 376-377) y otras como "tomato vein-greening" (Brown et al., 2010) o afecciones en zanahoria (Munyaneza et al., 2010. Plant Dis. 94, 639). Ca. L. solanacearum es transmitida por la psila Bacteriocera cockerelli (Hansen et al., 2008. Appl. Environ. Microbiol. 74, 5862-5865) y muy probablemente por otras especies. Se supone que Ca. L. solanacearum inoculada en cítricos podría inducir HLB como las otras especies de Ca. Liberibacter anteriormente reseñadas. La presencia de un psílido que fuera visitante de cultivos hortícolas y cítricos, podría provocar la transmisión de la bacteria de unos cultivos a otros.

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1. Procedimiento directo de detección específica de Candidatus Liberibacter spp., mediante dianas inmovilizadas y PCR a tiempo real, caracterizado porque comprende las etapas de: i) Inmovilización de las dianas para PCR a tiempo real de muestras vegetales o de artrópodos que las contienen, en un soporte sólido, y ii) Extracción de las dianas para PCR a tiempo real con agua destilada o un agente capaz de solubilizar dichas dianas.

2. Procedimiento directo de detección específica de Candidatus Liberibacter spp., mediante dianas inmovilizadas y PCR a tiempo real, según reivindicación 1ª, caracterizado porque en la conservación de las dianas inmovilizadas permite largos periodos de almacenamiento y su envío por correo para posterior análisis por PCR a tiempo real.

3. Procedimiento directo de detección específica de Candidatus Liberibacter spp., mediante dianas inmovilizadas y PCR a tiempo real, según reivindicación 1ª, caracterizado porque se emplea para analizar sistemáticamente por PCR a tiempo real, dianas inmovilizadas y conservadas en tubos Eppendorf o en pocillos de placas ELISA.

4. Procedimiento directo de detección específica de Candidatus Liberibacter spp., mediante dianas inmovilizadas y PCR a tiempo real, según reivindicación 1ª, caracterizado porque utiliza como iniciador directo para amplificación por PCR a tiempo real de Ca. Liberibacter spp. la secuencia (SEQ ID No 1) de 21 nucleótidos, deposición 15-36, de la secuencia de Ca. Liberibacter asiaticus 16S ribosomal RNA gene (GenBank nº L22532.1), denominada CaLf.

5. Procedimiento directo de detección específica de Candidatus Liberibacter spp., mediante dianas inmovilizadas y PCR a tiempo real, según reivindicación 1ª, caracterizado porque utiliza como iniciador reverso para amplificación por PCR a tiempo real de Ca. Liberibacter spp. la secuencia (SEQ ID No 2) de 21 nucleótidos, complementaria a la posición 103-124 de la secuencia de Ca. Liberibacter asiaticus 16S ribosomal RNA gene (GenBank nº L22532.1), denominada CaLr.

6. Procedimiento directo de detección específica de Candidatus Liberibacter spp., mediante dianas inmovilizadas y PCR a tiempo real, según reivindicaciones anteriores, caracterizado por el uso de dichas secuencias para la fabricación de un kit completo de diagnóstico, detección, identificación o caracterización de Ca. Liberibacter spp. o de sus especies separadas.