PROCEDIMIENTO PARA DETECTAR EL PRECIPITADO DE X-GAL U OTROS PRECIPITADOS OPACOS MEDIANTE MICROSCOPIA CONFOCAL.

La presente solicitud de patente se refiere a un procedimiento para la obtención de imágenes confocales de la tinción histológica Xgal,

el cual se puede combinar con otros fluoróforos usados en inmunofluorescencia permitiendo por tanto el marcaje múltiple y la localización del precipitado Xgal a nivel celular. Además se reivindica un método correctivo que permite la visualización en microscopia confocal del precipitado Xgal y otros precipitados opacos.

Procedimiento para detectar el precipitado de X-gal u otros precipitados opacos mediante microscopía confocal,

Sector de la Técnica El área científico-técnica en el que se desarrolla la invención es en el campo de la investigación biomédica y se refiere a un nuevo procedimiento para realizar adquisición de imágenes confocales de la tinción histológica Xgal, una técnica de amplio uso en el ámbito de la Biomedicina (Biología, Medicina experimental, Bioquímica, Farmacología....) , así como al diseño de un software que automatice y facilite la adquisición de dichas imágenes.

El sector de actividad en el que se aplicaría la invención es en la investigación e industria biomédica, más concretamente en el campo de la microscopía confocal. Igualmente podría tener interés en el campo de las ciencias de los materiales.

Estado de la técnica La tinción histológica Xgal se ha desarrollado en los últimos años como uno de los principales método de visualización de la expresión génica en animales de experimentación. Este método se basa en la utilización del gen bacteriano LacZ, que codifica la expresión de la enzima -galactosidasa, como marcador de expresión génica (Sanchez et al., 1996; Studer et al., 1996) . El sustrato empleado para visualizar la tinción Xgal es el 5-bromo-4chloro-3-indolyl -D-galactopiranosida (Xgal) . La adición de dicho sustrato, tras la correspondiente reacción de la galactosidasa, permite una fácil e inequívoca detección de expresión génica mediante un precipitado azul, el cuál puede ser visualizado mediante microscopía de campo claro. La tinción Xgal se puede realizar tanto en secciones de tejido como en órganos completos, siendo el método más utilizado para la inequívoca detección de la expresión génica mediante el uso de determinadas líneas de animales genéticamente modificados. Entre estas líneas de ratones genéticamente modificados se incluye la línea de ratones inducibles mediante la Cre-recombinasa ROSA-26 (Soriano, 1999) la cuál es la línea de animales más utilizada en estudios de visualización de la expresión génica.

El único sistema para la visualización de la expresión génica que rivaliza con la tinción Xgal es la proteína fluorescente verde (GFP, del inglés "Green Fluorescence Protein") , sin embargo la tinción Xgal ofrece un menor umbral de detección y una mejor relación señal-ruido que la GFP. No obstante la tinción Xgal tiene una gran desventaja frente a la GFP, ya que no permite realizar adquisiciones con microscopía confocal. Esto impide que aunque se combine con un segundo marcador (ya sea mediante inmunofluorescencia o la propia GFP) se pueda realizar una correcta localización celular del precipitado Xgal en secciones de tejido, imposibilitando determinar de forma fehaciente el tipo celular responsable de dicha expresión génica (Seymour et al., 2007) . La gran desventaja que supone el hecho de no poder adquirir imágenes confocales con la tinción Xgal se intenta salvar mediante inmunofluorescencia con anticuerpos específicos contra la enzima -galactosidasa. Sin embargo, esta solución ofrece los problemas clásicos de la inmunofluorescencia: un umbral de detección alto y una gran susceptibilidad a ofrecer falsos positivos. Recientemente se ha descrito un método que permite la visualización fluorescente del precipitado Xgal y por tanto la realización de microscopía confocal (Matei et al., 2006) . Sin embargo este método requiere un complejo proceso previo de fotoactivación del precipitado Xgal mediante un láser de zafiro dopado con titanio, el cuál no es comúnmente instalado en la mayoría de microscopios confocales. Además, este método de fotoactivación del precipitado Xgal resulta en la emisión de fluorescencia en el ancho rango de espectro de la luz visible (500-620) , lo que imposibilita la utilización de los fluoróforos con la excitaciones en la zona del espectro de emisión que abarca de la zona verde hasta la roja más comúnmente utilizados para realizar colocalización de subestructuras.

Explicación de la invención

La tinción histológica Xgal permite una fácil e inequívoca detección de expresión génica mediante su visualización con microscopía de campo claro. No obstante actualmente la tinción Xgal no permite realizar adquisiciones con microscopía confocal, lo que impide que aunque se combine con un segundo marcador se pueda realizar una correcta localización celular del precipitado Xgal en secciones de tejido.

El procedimiento objeto de la presente invención posibilita la adquisición de imágenes confocales del precipitado Xgal sin ningún proceso previo de fotoactivación, y consiste en la excitación del precipitado Xgal con una longitud de onda por encima de los 600 nm y la detección de la emisión de la fluorescencia a las longitudes de ondas más largas. Además, un adecuado procesado de dicha emisión de fluorescencia con un método correctivo permite la adquisición de imágenes confocales, localizando de manera inequívoca a nivel celular el precipitado Xgal. La obtención de imágenes de fluorescencia por el precipitado Xgal permite combinar este procedimiento con el uso de otros fluoróforos normalmente utilizados en inmunofluorescencia. Esto permite una fácil determinación de la célula

en que está localizado el precipitado al combinar este procedimiento con inmunofluorescencia para marcadores específicos del tipo celular en cuestión.

El procedimiento que esta patente propone posibilita la adquisición de imágenes confocales del precipitado Xgal. Para poder adquirir imágenes confocales de una muestra con el precipitado Xgal en secciones de tejido es necesario que al excitar el precipitado se pueda obtener una imagen fluorescente de éste. Por tanto en un primer abordaje se purificó el precipitado Xgal procedente de bacterias que expresaban -galactosidasa y que fueron tratadas con el sustrato Xgal. Una vez purificado el precipitado Xgal se realizó el espectro de absorción el cual se muestra en la Figura 1A, en dicho espectro se observa además de un gran pico de absorción en la zona de ultravioleta un pequeño pico de absorción en la zona por encima de 600 nm y hasta 700 nm, que se representa ampliado en la Figura 1B. Esto posibilita que excitando el precipitado Xgal con un haz de luz coherente por encima de los 600 nm éste produce una emisión con una longitud de onda superior a 650 nm (Figura 2) .

El hecho de que al excitar el precipitado Xgal con una longitud de onda por encima de 600 nm éste produzca una emisión con una longitud de onda superior a 650 nm permite obtener una imagen fluorescente del precipitado mediante el microscopio confocal. En la figura 3 se exponen imágenes obtenidas mediante microscopía confocal excitando el precipitado Xgal a distintas longitudes de onda. Como se muestra en dicha figura la excitación del precipitado con una longitud de onda de 633 nm permite obtener una imagen fluorescente de éste mediante microscopía confocal.

No obstante, al trasladar dicha invención a secciones de tejido se obtiene una imagen fluorescente con una mala relación señal/ruido (véase Figura 5A-B) . En el procedimiento objeto de la invención se propone un proceso que permite mejorar dicha relación señal/ruido. Este consiste en sustraer de la imagen digital de fluorescencia la señal digital de la transmitancia de la sección en estudio, que es obtenida mediante escaneo simultáneo de la señal de luz transmitida. Es importante que el haz de luz coherente utilizado para la detección de la señal de luz transmitida sea por encima de los 600 nm, ya que en estas longitudes de onda la luz del haz tiene la mayor dispersión, por ello se obtiene una imagen más contrastada. Esta adquisición nos permite ajustar los valores de transmitancia a mínimos (cercanos a 0) para el precipitado Xgal (Figura 4) .

La sustracción de la señal de transmisión en las zonas de la sección donde exista precipitado Xgal no disminuirá la señal de fluorescencia, ya que dicho precipitado es opaco por lo que absorbe toda la luz y por tanto tendría un valor de transmitancia cercano a 0 (Figura 4) . Sin embargo en las zonas de la sección donde no estuviera el precipitado Xgal los valores de absorbancia serán mayores, esto permite que al restar dichos valores de la imagen de fluorescencia se disminuye en gran medida la señal inespecífica (Figura 5C) . Por tanto al sustraer los valores de la transmitancia de la sección de la imagen de fluorescencia obtenida se consigue una señal fluorescente del precipitado Xgal totalmente nítida y localizada, la cuál coincide perfectamente en el mismo plano confocal con el precipitado Xgal (Figura 5C-D) . El hecho de poder obtener una señal fluorescente nítida e inequívoca del precipitado Xgal permite...

1. Procedimiento para detectar el precipitado de Xgal mediante microscopía confocal sin proceso previo de fotoactivación, caracterizado porque comprende las etapas de:

a) excitar la muestra con luz coherente de una longitud de onda del intervalo d.

60. 700 nm;

b) recoger la señal de fluorescencia emitida por la muestra en el intervalo de longitud de onda cuyo límite inferior es un valor de longitud de onda 5-10 nm por encima de la luz de excitación y cuyo límite superior son 750 nm.

2. Procedimiento para detectar el precipitado de Xgal mediante microscopia confocal según la reivindicación 1, caracterizado porque se recoge la señal emitida por la muestra en el intervalo d.

65. 750 nm.

3. Procedimiento para detectar el precipitado de Xgal mediante microscopía confocal según la reivindicación 1 ó 2, caracterizado porque la longitud de onda de la luz de excitación es de 633 nm.

4. Procedimiento descrito según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque se realiza el escaneo de la señal transmitida por la sección de la muestra en estudio, de manera simultánea a la adquisición de la señal de fluorescencia/reflexión emitida por la muestra, tras lo cual se resta al valor de la señal del fluorescencia/reflexión el valor de la señal de transmitancia, de manera que la imagen fluorescente/reflexión final corresponde al resultado de dicha sustracción.

5. Procedimiento descrito según la reivindicación 4, caracterizado porque el haz de luz coherente utilizado para la detección de la señal de luz transmitida tiene una longitud de onda superior a 600 nm.

6. Procedimiento descrito según cualquiera de las reivindicaciones anteriores, caracterizado porque comprende las etapas adicionales de:

a) incubar la muestra con un compuesto que comprende un resto fluoróforo que emite en el intervalo de longitudes de onda d.

45. 594 nm;

b) excitar la muestra con luz coherente con una longitud de onda capaz de excitar el resto fluoróforo y provocar la emisión de luz de fluorescencia por parte del mismo;

c) recoger la señal de fluorescencia emitida por la muestra con un valor de longitud de onda igual al valor de la luz de emisión de fluorescencia del resto fluoróforo.

7. Un producto de instrucciones electrónicas, caracterizado porque comprende un medio de lectura informático y un código de programa de lectura informático, registrado en el medio de lectura informático, adecuado para instruir a un sistema de procesamiento de datos de un sistema informático a realizar los cálculos relacionados con el método una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

8. Un producto de instrucciones electrónicas según la reivindicación 7, caracterizado porque comprende, además, un código de programa de lectura informático, registrado en el medio de lectura informático, adecuado para instruir al sistema de procesamiento de datos para controlar un método según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6.

9. Un sistema informático, que comprende un producto de programas informáticos y un sistema de procesamiento de datos configurado para recibir instrucciones leídas de la producción de programas informáticos, caracterizado por que el producto de programas informáticos es según la reivindicación 7 u 8.