PROCEDIMIENTO DE DETECCIÓN Y/O CUANTIFICACIÓN Y/O IDENTIFICACIÓN IN VITRO DE COMPUESTOS INFECCIOSOS EN UN MATERIAL BIOLÓGICO.

Procedimiento de detección y/o cuantificación y/o identificación in vitro de compuestos infecciosos (CI) presentes en un medio fluido M que constituye una material biológico,

procedimiento en el cual, de modo conocido, se prepara una suspensión, en un medio líquido de suspensión, de microbolas delimitadas por un superficie externa constituida por un material polímero sólido susceptible de fijar proteínas, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) se asegura una carga de las microbolas de la suspensión con proteínas ß2GPI por acoplamiento con una cantidad suficiente de proteínas ß2GPI, bien sea de forma pasiva en un medio de suspensión o bien sea utilizando un protocolo de unión química conocido;

b) se ponen en contacto, en un recipiente, dichas microbolas cargadas con proteínas ß2GPI con el medio fluido M añadiendo iones de al menos un metal oxidante, en condiciones apropiadas para asegurar una fijación suficiente de los compuestos infecciosos sobre las proteínas ß2GPI llevadas por las microbolas;

c) se separan las microbolas así preparadas de su medio de suspensión, se evacua dicho medio de suspensión del contenedor para obtener, eventualmente después de un lavado con un tampón, un residuo con una fuerte concentración de compuestos infecciosos;

d) y se detectan y/o cuantifican y/o identifican los compuestos infecciosos a partir del residuo concentrado así obtenido.

Procedimiento de detección y/o cuantificación y/o identificación in vitro de compuestos infecciosos en un material biológico.

La presente invención se refiere a un procedimiento de detección y/o cuantificación y/o identificación in vitro de compuestos infecciosos en un material biológico.

En la presente solicitud de patente, se entiende por "material biológico" un tejido biológico, una preparación o un extracto procedente de tejido biológico, líquido o sólido, o un medio, natural o no, susceptible de contener compuestos infecciosos, por ejemplo un agua de vertido o un agua de lavado de frutas y legumbres. Dicho material puede ser también una mezcla de al menos dos materiales, tales como los definidos antes; por consiguiente puede bien ser preparado, principalmente, a partir de tejidos, órganos, heces o líquidos biológicos de un enfermo que padece una infección, o bien ser obtenido a partir de cultivos "in vitro"; dicho material biológico también puede ser suero, plasma, orina, líquido cefalo-raquídeo, líquido sinovial, líquido peritoneal, líquido pleural, líquido seminal o líquido ascítico.

En la presente solicitud de patente, se entiende por compuestos infecciosos, en lo sucesivo denominados de modo genérico abreviadamente "CI", tanto los compuestos, en particular proteínicos, constitutivos de un agente infeccioso, como las estructuras que comprenden compuestos infecciosos. Estas estructuras son, principalmente, o bien agentes infecciosos endógenos o exógenos, completos o incompletos, su metabolito o incluso combinaciones que contienen los compuestos constitutivos de estos agentes infecciosos, combinaciones que presentan ciertas propiedades de dichos agentes infecciosos, principalmente la propiedad de ser detectado por ciertos anticuerpos específicos de los compuestos infecciosos; los CI también pueden ser compuestos específicamente inducidos en el organismo por los CI definidos precedentemente, o por la expresión de genes que se expresan de modo anómalo. Entre los CI se pueden citar, por ejemplo, virus, bacterias, hongos, micoplasmas, parásitos y células animales anómalas.

Ya se ha descrito una glicoproteína plasmática denominada 2-glicoproteína I, o incluso abreviadamente "2GPI"; la secuencia de esta glicoproteína humana ha sido indicada principalmente en los artículos de J. LOZIER et al., Proc. Natl. Acad. Sci. USA, Vol. 81, pp. 3640-3644 (julio 1984) y de T. KRISTENSEN et al., FEBS Letters, Vol. 289, pp.183-186 (1991) . Se ha comprobado que esta proteína 2GPI presenta un polimorfismo: la denominación 2GPI será considerada en lo sucesivo como genérica para todas las formas.

En la solicitud de patente internacional WO 94/18569, se ha indicado que ciertos compuestos infecciosos, en particular proteínicos, se fijaban sobre la forma de 2GPI que había sido descrita en la patente francesa 2.701.263. En el documento WO 94/18569, se ha propuesto un procedimiento de detección y/o valoración de compuestos virales en el cual se fijan los compuestos infecciosos virales sobre la forma de 2GPI utilizada; se añade pues esta forma de

2GPI sobre compuestos infecciosos virales contenidos en un material biológico, de modo que se separen los compuestos virales así capturados para a continuación detectarlos y valorarlos. En la patente europea EP 775315, se ha descrito la formación de un complejo entre un compuesto infeccioso, en particular proteínico, y una forma cualquiera de 2GPI; el compuesto infeccioso podía ser, principalmente una bacteria. De dichos documentos se deduce que la

2GPI es susceptible de fijarse sobre un soporte sólido plano, tal como los fondos de un pocillo de una placa de microtitulación, y que la 2GPI así atrapada sobre dicho soporte sólido plano, es susceptible de fijar los compuestos infecciosos (Cl) presentes en las muestras clínicas, biológicas o medioambientales a concentraciones muy bajas. Se sabe, además, que dichas muestras pueden contener sustancias que inhiban, al menos parcialmente, la detección de agentes patógenos, sustancias que, por consiguiente, pueden disminuir la sensibilidad de la detección. Por tanto es importante poder capturar y concentrar estos agentes patógenos para eliminar las sustancias que inhiben su detección.

Los estudios de la sociedad solicitante han mostrado que la fijación de la 2GPI sobre el fondo de los pocillos de placas de titulación, se produce gracias a une conformación particular de la 2GPI, conformación que permitía ulteriormente la formación de un complejo de la 2GPI con un compuesto infecciosos. La literatura científica había señalado por otra parte que la conformación de la 2GPI variaba en su fijación sobre una superficie sólida (Matsuura et al., J. Exp. Med. 179, pp. 457-462 (1994) ) . Ya se había descrito (A. IWATA et al., Biol. Pharm. Bull. 26 (8) , pp. 10651069 (2003) ) un procedimiento de concentración de virus que utiliza microbolas magnéticas sulfonadas sobre las cuales quedaban atrapados los virus, obteniéndose la concentración de los virus gracias al hecho de que las microbolas eran magnéticas y podían ser separadas del medio infeccioso por acción de un campo magnético. Desafortunadamente el resultado de esta técnica era esencialmente función del atrapamiento de los virus sobre las microbolas. Este documento explica de modo detallado que ciertos virus carentes de envolvente no se fijan sobre las microbolas de polietilenimina y que es necesario utilizar microbolas sulfonadas para concentrar ciertos virus. Además, para ciertos virus, era necesario añadir al medio cationes divalentes, tales como Zn2+ o Cu2+. De esta constatación se deduce que, según la naturaleza del virus, el polímero que constituye las microbolas debe ser diferente, injertado o no, y que los iones divalentes son necesarios o no; por consiguiente las bolas deben ser preparadas caso por caso en función del virus que se ha de concentrar. Las mismas constataciones resultan del documento de E. UCHIDA et al., Journal of Virological Methods, 143, pp. 95-103 (2007) , que se refiere a la concentración de los virus de las hepatitis A, B, C humanas. En presencia de una muestra que contiene un virus no identificado que hay que detectar, no era pues posible determinar que naturaleza de microbolas era susceptible de dar lugar a un atrapamiento del virus de interés.

En consecuencia, teniendo en cuenta los inconvenientes antes mencionados, un experto en la técnica habría tenido que decidirse a buscar las condiciones medioambientales favorables para que las microbolas pudieran atrapar compuestos infecciosos cualquiera que fuera su naturaleza o su identidad. Esto es por otra parte los pasos seguidos por UCHIDA en su artículo antes citado; dicho autor ha descrito las condiciones particularmente favorables para la captura directa de los virus VHA, VHB y VHC. La sociedad solicitante, sin embargo, ha abordado estos pasos proponiendo, según la presente invención, interponer una molécula de 2GPI, entre una microbola y un compuesto infeccioso (Cl) que ha de ser fijado encima. El estado de la técnica ha permitido determinar la naturaleza de los soportes sólidos que permiten un buen atrapamiento de la proteína 2GPI; la fijación de la 2GPI sobre una microbola se efectúa entonces sin que el polímero de la microbola tenga que ser modificado en función del compuesto infeccioso que se ha de fijar ulteriormente. Y, además, se ha comprobado que la fijación de la 2GPI sobre la microbola no perturbaba el atrapamiento del compuesto infeccioso sobre la 2GPI; ahora bien, este último punto era totalmente inesperado porque no se podía prever que la conformación de la 2GPI fijada sobre una microbola, permitiera el atrapamiento de un agente patógeno sobre la glicoproteína. Por otra parte y de modo complementario, un elemento disuasorio para conducir a la invención provenía del hecho que se sabía que la 2GPI tenía tendencia a autopolimerizarse (véase: Thrombosis Research, 108, pp. 175-180 (2003) ) , lo que tenía el riesgo de implicar un aglutinación de las microbolas portadoras de 2GPI, aglutinación que, naturalmente, haría impensable la fijación de agentes patógenos sobre las moléculas de 2GPI.

Finalmente, se ha comprobado, según la invención, que el atrapamiento de los compuestos infecciosos sobre las microbolas cargadas de 2GPI permitía, en ciertos casos, por contacto directo de las microbolas cargadas de 2GPI y del CI con un medio apropiado, detectar, cuantificar o identificar los CI atrapados. En el caso de los virus, dicho medio es un cultivo de células susceptibles de ser infectadas por los virus capturados por las microbolas.

Según otro aspecto de la invención, la sociedad solicitante también ha buscado,... [Seguir leyendo]

Procedimiento de detección y/o cuantificación y/o identificación in vitro de compuestos infecciosos (CI) presentes en un medio fluido M que constituye una material biológico, procedimiento en el cual, de modo conocido, se prepara una suspensión, en un medio líquido de suspensión, de microbolas delimitadas por un superficie externa constituida por un material polímero sólido susceptible de fijar proteínas, caracterizado porque comprende las etapas siguientes:

a) se asegura una carga de las microbolas de la suspensión con proteínas 2GPI por acoplamiento con una cantidad suficiente de proteínas 2GPI, bien sea de forma pasiva en un medio de suspensión o bien sea utilizando un protocolo de unión química conocido;

b) se ponen en contacto, en un recipiente, dichas microbolas cargadas con proteínas 2GPI con el medio fluido M añadiendo iones de al menos un metal oxidante, en condiciones apropiadas para asegurar una fijación suficiente de los compuestos infecciosos sobre las proteínas 2GPI llevadas por las microbolas;

c) se separan las microbolas así preparadas de su medio de suspensión, se evacua dicho medio de suspensión del contenedor para obtener, eventualmente después de un lavado con un tampón, un residuo con una fuerte concentración de compuestos infecciosos;

d) y se detectan y/o cuantifican y/o identifican los compuestos infecciosos a partir del residuo concentrado así obtenido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, caracterizado porque se efectúa la carga de las microbolas, en la etapa a) de la reivindicación 1, de modo pasivo en un tampón que tiene un pH comprendido entre 3, 5 y 10, 5, dejando en incubación, durante un tiempo comprendido entre 10 minutos y 24 horas, a une temperatura comprendida entre 4 y 40º C.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 o 2, caracterizado porque se efectúa la carga de las microbolas con proteínas 2GPI poniéndolas en un medio líquido de suspensión que contiene, en solución acuosa, de 10-6 a 100 mg de 2GPI por gramo de peso seco de microbolas, estando comprendida la concentración del medio en 2GPI entre 10-5 y 10 μg/μl.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque la carga de las microbolas con proteínas 2GPI se efectúa en un tampón que tiene un pH comprendido entre 5 y 9 con una incubación durante un tiempo comprendido entre 10 minutos y 24 horas a una temperatura comprendida entre 4 y 40º C.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque en la etapa b) , los iones de metal oxidante añadidos al medio M son iones cúpricos, estando comprendida la concentración de iones cúpricos en el medio M, después de dicha adición, entre 1 mM y 100 mM.

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque el material sólido constitutivo de la superficie externa de las microbolas se elige del grupo formado por materias plásticas y elastómeros, llevando

o no dicho material grupos reactivos injertados en la superficie externa de las microbolas para asegurar un enlace químico con las proteínas 2GPI.

7. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque se eligen las microbolas que tienen una forma sensiblemente esférica y un diámetro medio comprendido entre 1 y 100.000 nm.

8. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque se eligen las microbolas que tienen un núcleo formado de una o varias partículas de material magnético para permitir su separación con respecto al medio de suspensión gracias a un campo magnético.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizado porque las microbolas se separan por centrifugación de su medio de suspensión.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizado porque se realiza la etapa d) de la reivindicación 1 por un medio elegido del grupo formado por infecciosidad, una reacción enzimática específica, un trazador fluorescente o radiomarcado, una detección de ácidos nucleicos específicos por hibridación con una sonda marcada, una reacción PCR o RT-PCR, una valoración, un recuento, una visualización, un procedimiento óptico, una microscopía electrónica o no.

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los compuestos infecciosos son bacterias.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizado porque los compuestos infecciosos son virus.

13. Procedimiento según la reivindicación 11, caracterizado porque se detectan y/o cuantifican y/o identifican las

bacterias del medio fluido M a partir del residuo por lectura de la densidad óptica, por ATP-metría o por PCR.

14. Procedimiento según una de las reivindicaciones 11 a 13, caracterizado porque los ácidos nucleicos de los CI de interés se extraen por lisis, a partir del residuo concentrado, porque dichos ácidos nucleicos se amplifican por PCR o RT-PCR, utilizando los cebadores apropiados para dichos CI de interés y porque se practica una visualiza ción sobre gel de los ácidos nucleicos eventualmente obtenidos para definir la presencia o ausencia de dichos Cl de interés y/o para cuantificar la carga viral de dichos CI de interés en el medio M.

15. Procedimiento según la reivindicación 12, caracterizado porque para detectar y/o identificar los virus de interés fijados sobre las microbolas obtenidas según la etapa c) de la reivindicación 1, se vuelve a poner en suspensión el residuo, se ponen en contacto dichas microbolas con células sensibles a los virus de interés, se cultivan di

chas células y se observa la eventual infección de las células por los virus de interés.

16. Procedimiento según la reivindicación 15, caracterizado porque, para detectar une infección de células, se observa el efecto citopatológico de los virus después de una coloración apropiada de las células, o inmunofluorescencia después de fijación de las células y reacción con anticuerpos fluorescentes que reconocen proteínas correspondientes a la presencia de virus.