PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE LAS FORMAS PROTEICAS CIRCULANTES DE AGREGACION UTILIZANDO UN AGENTE DE AGREGACION DE LAS FORMAS PROTEICAS CIRCULANTES DE AGREGACION Y UN AGENTE DE CAPTURA DE LOS AGREGADOS FORMADOS.

Procedimiento de detección de al menos una forma proteica circulante de agregación (FCPA) vinculada a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas en una muestra biológica de origen humano susceptible de contener dichas FCPA,

conteniendo dichas FCPA:

a) aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen todas una función ácida o una función aceptora de puentes de hidrógeno y que estén presentes globalmente al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos y

b) un mínimo de tres aminoácidos básicos en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a quince aminoácidos,

caracterizado porque emplea un agente 1 no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina, bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina y un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FCPA o inducidos por dichos agentes I, que es un metaciclofano o un glucosaminoglucano, y porque realiza la revelación de la presencia de dichas FCPA

Procedimiento de detección de las formas proteicas circulantes de agregación utilizando un agente de agregación de las formas proteicas circulantes de agregación y un agente de captura de los agregados formados.

La presente invención se refiere al campo de las enfermedades neurodegenerativas reconocidas como no infecciosas actualmente, y en particular a un procedimiento de detección de las formas proteicas circulantes de agregación vinculadas a estas enfermedades.

El crecimiento de las enfermedades vinculadas al envejecimiento afecta cada vez más a nuestras poblaciones cuya media de edad ha crecido fuertemente durante el último siglo. Algunas de estas enfermedades afectan al cerebro y parecen afectar a todas las funciones cognitivas. Los ataques contra las funciones sensoriomotrices también pueden ser importantes en algunas de estas enfermedades. Estas son las enfermedades llamadas neurodegenerativas reconocidas como no infecciosas actualmente, tales como la enfermedad de Parkinson, enfermedad de Alzheimer, tauopatías, demencias con cuerpos de Lewy, enfermedad de Huntington y demencias vasculares.

De este modo, por ejemplo, más de 25 millones de personas en el mundo padecen enfermedad de Alzheimer. En Francia, casi 800.000 personas están afectadas por la enfermedad de Alzheimer o por enfermedades emparentadas. Además, el envejecimiento demográfico de la población se acentúa y conducirá a un aumento de este número. Ya se cuentan cerca de 165.000 nuevos enfermos al año. La enfermedad de Alzheimer representa la cuarta causa de mortalidad, después de las afecciones cardiovasculares, los cánceres y los accidentes cerebrovasculares (ACV). Esta demencia neurodegenerativa conduce progresiva e irreversiblemente a la pérdida de la memoria (amnesia) y de las funciones cognitivas (afasia, apraxia, agnosia).

Como la enfermedad de Alzheimer, las principales enfermedades neurodegenerativas no infecciosas se caracterizan por depósitos extracelulares y/o intracelulares constituidos por proteínas no infecciosas que pueden estar presentes en forma circulante (formas proteicas circulantes de agregación o FPCA) y están implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central. Estas proteínas pueden experimentar modificaciones conformacionales espontáneas, inducidas por co-factores o enzimas, o también por mutaciones genéticas que favorecen su agregación espontánea en forma de depósitos proteicos; estas modificaciones conllevan una acumulación en diferentes zonas cerebrales según el tipo de proteína y según las circunstancias fisiopatológicas (El-Agnaf O et al., 2003, Lancet Neurol, 2: 461-462).

De este modo, en el caso de la enfermedad de Alzheimer, las proteínas agregadas son principalmente la proteína Tau y fragmentos de la proteína APP (Proteína Precursora de Amiloide, [Amyloid Precursor Protein]), los péptidos beta-amiloides (beta 1-40, beta 1-41, beta 1-42, por ejemplo). La proteína Tau también está asociada a las tauopatías, demencias no de tipo Alzheimer asociadas a depósitos de proteína Tau agregada en el cerebro en ausencia de proteína beta-amiloide. La proteína APP y/o sus fragmentos peptídicos beta-amiloides también están asociados a las demencias vasculares, caracterizadas por depósitos perivasculares de agregados amiloides. En el caso de la enfermedad de Parkinson, caracterizada por una degeneración neuronal a nivel de los núcleos grises centrales, una proteína asociada es la Parkina, particularmente para las formas familiares, así como la alfa-sinucleína. Esta última también está implicada en la demencia de Parkinson que puede sobrevenir en añadidura de los trastornos sensoriomotrices. La alfa-sinucleína también está asociada a las demencias con cuerpos de Lewy. Estas últimas se caracterizan por un depósito de proteína alfa-sinucleína agregada, particularmente en zonas de la corteza frontal, lo que genera una degeneración neuronal con afectación de las funciones cognitivas que desemboca en un síndrome demencial. En el caso de la enfermedad de Huntington, la proteína agregante es la Huntingtina. De este modo, este fenómeno de depósitos cerebrales de agregados proteicos neurotóxicos se encuentra en la mayor parte de las enfermedades neurodegenerativas pero, al contrario que las enfermedades llamadas "con priones", las proteínas asociadas a las enfermedades neurodegenerativas no presentan propiedades infecciosas y no son, por lo tanto, transmisibles. En efecto, las proteínas "Prión" son los agentes vectores de las encefalopatías espongiformes transmisibles y, mediante inyección de estos priones patógenos aislados en individuos enfermos, puede transmitirse la enfermedad; esto también es válido para las enfermedades con priones de origen genético, como la enfermedad de Gertsmann-Straüssler-Scheinker (GSS), cuyo prión patológico es iniciado por las mutaciones genéticas del huésped pero cuya proteína patológica, una vez formada, adquiere las propiedades infecciosas propias de las enfermedades con priones (Lantos PL., 1992, Histopathology, 20(1): 1-11). Las "enfermedades con priones" resultan del crecimiento progresivo de la cantidad de proteína prión patógena en el individuo inoculado o contaminado con estas últimas, o también portador de mutaciones genéticas capaces de iniciar la conversión patológica de la proteína normal, creando de este modo una "infección endógena".

Las proteínas asociadas a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas se diferencian particularmente de estas últimas por su incapacidad para transmitir la enfermedad mediante inyección sistémica a un individuo sano. Del mismo modo, ningún elemento tisular procedente de estas enfermedades neurodegenerativas no infecciosas ha podido transmitir la enfermedad, lo que excluye que estas últimas sean enfermedades infecciosas, al contrario que las enfermedades con priones.

El diagnóstico actual de estas enfermedades neurodegenerativas no infecciosas se basa generalmente en la formación de imágenes, que completa el examen clínico y neuropsicológico. Éste es un procedimiento pesado y costoso que requiere varias etapas de diagnóstico, no realizándose ninguna sobre una muestra biológica. En algunos casos, una mutación de origen genético es el origen de la agregación anormal de una de estas proteínas, es posible un diagnóstico genético a nivel de las secuencias de ADN, pero esto sigue siendo poco frecuente respecto a las formas "no genéticas".

Un diagnóstico de estas enfermedades más fácil y rápido es, por lo tanto, necesario. El diagnóstico en muestras biológicas de ser humano se ha vuelto, por lo tanto, de extrema importancia. Particularmente, su detección inmunológica permitiría un diagnóstico más sencillo, incluso más precoz, con un ahorro evidente sobre las conductas terapéuticas a iniciar antes de la extensión de las lesiones (El-Agnaf O et al., 2003, supra).

Varios equipos se han sumado a los esfuerzos para conseguir dicha detección en muestras biológicas. De este modo, la solicitud de patente EP 713 095 describe el diagnóstico en el líquido cefalorraquídeo (LCR) de un paciente afectado por la enfermedad de Alzheimer mediante medición de la cantidad de un péptido ß-amiloide, opcionalmente en asociación con la medición de la cantidad de la proteína Tau, y comparación con un valor predeterminado. Este método tiene el inconveniente que solamente se ha demostrado para el LCR y que la detección de péptido ß-amiloide debe completarse en éste mediante una dosificación de proteína Tau, para mejorar la especificidad del test (Sjogren M et al., 2003, Clin Chim Acta, 332: 1-10).

Actualmente no existe ningún diagnóstico biológico rutinario sanguíneo para estas enfermedades neurodegenerativas no infecciosas. Por ejemplo, la proteína Tau es difícil de detectar en la sangre, ya que solamente se produce en las neuronas y se encuentra muy diluida en la sangre, después del paso por el LCR. Además, en este último, la proteína Tau es más o menos bien detectada por los ensayos existentes. El empleo de la dosificación de la proteína APP y de sus fragmentos circulantes, entre los cuales la proteína precursora, puede producirse en las plaquetas sanguíneas, sigue siendo problemático ya que muchas FPCA están unidas a proteínas plasmáticas que pueden enmascarar epítopos y, de este modo, hacerles indetectables y/o no capturables por anticuerpos dirigidos contra estos mismos epítopos. Por lo tanto, no es posible, ya que los epítopos enmascarados son aquellos que reconocen a los anticuerpos utilizados, utilizar procedimientos inmunoenzimáticos convencionales de tipo "ELISA sándwich". Además,...

1. Procedimiento de detección de al menos una forma proteica circulante de agregación (FCPA) vinculada a las enfermedades neurodegenerativas no infecciosas en una muestra biológica de origen humano susceptible de contener dichas FCPA, conteniendo dichas FCPA:

caracterizado porque emplea un agente 1 no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina, bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina y un agente II no proteico de captura de los agregados naturales de FCPA o inducidos por dichos agentes I, que es un metaciclofano o un glucosaminoglucano, y porque realiza la revelación de la presencia de dichas FCPA.

2. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque dicho agente I se añade a dicha muestra biológica para la agregación de las FCPA antes que dicho agente II.

3. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con la reivindicación 2, caracterizado porque comprende las etapas que consisten en:

4. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizado porque comprende al menos una de las siguientes etapas suplementarias i) y ii) que consisten en:

estando estas etapas incluidas, llegado el caso, entre la etapa a) y la etapa b).

5. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, caracterizado porque se añade al menos un socio de unión específico de las FCPA para una reacción inmunológica entre el socio de unión específico de las FCPA y las FCPA, llegado el caso en la etapa c).

6. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizado porque dicho agente II está unido a un soporte sólido.

7. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, caracterizado porque el metaciclofano es p-sulfonato-3,7-(2-aminoetiloxi)-calix-[6]-areno.

8. Procedimiento de detección de al menos una FCPA vinculada a enfermedades neurodegenerativas no infecciosas, conteniendo dichas FCPA aminoácidos cuyas cadenas laterales tienen una función ácida o una función aceptora de puentes de hidrógeno y que están presentes globalmente al menos 4 veces en una secuencia peptídica de longitud inferior o igual a 20 aminoácidos, caracterizado porque comprende la etapa de puesta en contacto de una muestra biológica, procedente u obtenida de un organismo humano, con un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina, bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina y porque realiza la revelación de la presencia de dichas FCPA.

9. Procedimiento de detección de al menos una FCPA de acuerdo con la reivindicación 8, caracterizado porque se añade al menos un socio de unión específico de las FCPA para una reacción inmunológica entre el socio de unión específico de las FCPA y las FCPA.

10. Utilización de un kit de diagnóstico que comprende un agente I no proteico que produce la agregación de las formas circulantes de las proteínas no infecciosas implicadas en procesos de agregación patológica del sistema nervioso central, que se selecciona entre rifampicina, isoniazida, etambutol, trietilentetraamina, bis-3-aminopropilamina, tetraclorhidrato de espermina, sesquisulfato de dihidroestreptomicina y estreptomicina para la detección de al menos una FCPA vinculada a enfermedades neurodegenerativas no infecciosas.

11. Utilización de un kit de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque también comprende un metaciclofano o un glucosaminoglucano.