PROCEDIMIENTO DE SÍNTESIS DE ÁCIDO NUCLEICO.

La presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis de ácido nucleico compuesto por una secuencia nucleotídica específica, que es útil como procedimiento de amplificación de ácido nucleico. Técnica anterior Un procedimiento de análisis basado en la complementariedad de una secuencia nucleotídica de ácido nucleico puede analizar los rasgos genéticos directamente. En consecuencia, este análisis es un medio muy potente para la identificación de enfermedades genéticas, canceración, microorganismos etc. Además, un gen en sí mismo es el objeto de detección y, por tanto, en algunos casos se pueden omitir procedimientos engorrosos y que consumen tiempo tal como los cultivos. No obstante, la detección de un gen diana presente en una cantidad muy pequeña en una muestra en general no es fácil, por lo que es necesaria la amplificación de un gen diana en sí mismo o su señal de detección. Como procedimiento para amplificar un gen diana, se conoce la PCR (reacción en cadena de la polimerasa) (Science 230, 1350-1354, 1985). En la actualidad, el procedimiento de la PCR es el procedimiento más popular como técnica de amplificación de ácido nucleico in vitro. Este procedimiento se ha establecido firmemente como un excelente procedimiento de detección en virtud de su elevada sensibilidad basada en el efecto de la amplificación exponencial. Además, ya que el producto de amplificación se puede recuperar como ADN, este procedimiento se aplica extensamente como importante herramienta de soporte de las técnicas de ingeniería genética tales como clonación de genes y determinación estructural. No obstante, en el procedimiento de la PCR se han observado los siguientes problemas: es necesario un controlador especial de temperatura para la práctica; el proceso exponencial de la reacción de amplificación causa un problema en la cuantificación; y las soluciones de muestras y de reacción se contaminan con facilidad desde el exterior lo que permite la mezcla de ácidos nucleicos por error para actuar como molde. A medida que la información genómica se acumula, el análisis de polimorfismos de un solo nucleótido (SNP) atrae la atención. La detección de SNP por medio de PCR es factible a través del diseño de un cebador de modo que su secuencia nucleotídica contenga SNP. Es decir, se puede deducir si una secuencia nucleotídica complementaria al cebador está presente o no mediante la determinación de si está presente un producto de reacción o no. No obstante, una vez que se sintetiza una cadena complementaria por error en la PCR por casualidad, este producto funciona como molde en la reacción siguiente, lo que da lugar a un resultado erróneo. En la práctica, se dice que es difícil establecer un control estricto de la PCR con la diferencia de una única base dada en el extremo del cebador. En consecuencia, es necesario mejorar la especificidad con el fin de aplicar la PCR a la detección de SNP. Por un lado, en la práctica también se usa un procedimiento de síntesis de ácido nucleico mediante una ligasa. El procedimiento LCR (reacción en cadena de la ligasa, Laffler TG; Garrino JJ; Marshall RL; Ann. Biol. Clin. (París), 51:9, 821-6, 1993) se casa en la reacción en la que dos sondas adyacentes hibridan con una secuencia diana y se ligan entre sí mediante una ligasa. Las dos sondas no se podían unir en ausencia de la secuencia nucleotídica diana y, por tanto, la presencia del producto ligado es indicativa de la secuencia nucleotídica diana. Dado que el procedimiento de LCR también requiere el control de la temperatura para la separación de una cadena complementaria de un molde, surge el mismo problema que en el procedimiento de PCR. Para la LCR, también existe un informe de un procedimiento para mejorar la especificidad mediante la adición de la etapa de proporcionar un espacio entre la sondas adyacentes y rellenar el espacio con una ADN polimerasa. No obstante, lo que se puede esperar de este procedimiento modificado es únicamente especificidad y sigue existiendo un pro0blema en cuanto a que se requiere controlar la temperatura. Es más, el uso de la enzima adicional conlleva un incremento de los costes. Un procedimiento denominado el procedimiento SDA (amplificación por desplazamiento de hebras) [Proc. Natl. Acad. Sci. USA, 89, 392-396, 1992] [Nucleic Acid. Res., 20, 1691-1696, 1992] también se conoce como procedimiento para amplificar ADN que posea una secuencia complementaria a una secuencia diana como molde. En el procedimiento SDA, se usa una ADN polimerasa especial para sintetizar una cadena complementaria comenzando desde un cebador complementario al extremo 3 de una cierta secuencia nucleotídica mientras que desplaza una cadena de doble hebra, si existe, en el extremo 5' de la secuencia. En la presente descripción, la sencilla expresión "extremo 5'" o "extremo 3'" se refiere al de una cadena que sirva como molde. Dado que una cadena de la doble hebra en el extremo 5' es desplazada por una cadena complementaria recién sintetizada, esta técnica se denomina el procedimiento SDA. En el procedimiento de SDA se puede eliminar la etapa de variación de temperatura esencial en el procedimiento de la PCR mediante la inserción previa de una secuencia de reconocimiento por enzimas de restricción en una secuencia hibridada como un cebador. Es decir, una muesca generada por una enzima de restricción produce un grupo 3-OH que actúa como origen de la síntesis de la cadena complementaria y la cadena complementaria sintetizada previamente se libera en forma de cadena monohebra por síntesis de desplazamiento de cadena y, después, se utiliza de nuevo como molde para la posterior síntesis de la 2   cadena complementaria. De este modo, en el procedimiento de SDA no se requiere el complicado control de la temperatura esencial en la PCR. No obstante, en el procedimiento de SDA además de la ADN polimerasa para desplazamiento de la hebra se utilizará la enzima de restricción generadora de una muesca. Este requisito de la enzima adicional es una causa fundamental del coste más elevado. Además, dado que la enzima de restricción no se va a utilizar para la escisión de las cadenas de doble hebra sino para la introducción de una muesca (es decir, la escisión de sólo una de las cadenas), como sustrato para la síntesis se usará un derivado de dNTP tal como -tio dNTP para hacer que la otra cadena sea resistente a la digestión con la enzima. En consecuencia, el producto de amplificación mediante SDA posee una estructura diferente de la del ácido nucleico natural y existe un límite a la escisión con enzimas de restricción o la aplicación del producto de amplificación en la clonación de genes. A este respecto también es una causa fundamentar del coste más elevado. Además, cuando el procedimiento de SDA se aplica a una secuencia desconocida, existe la posibilidad de que la misma secuencia nucleotídica que la secuencia de reconocimiento de la enzima de restricción usada para introducir una muesca puede estar presente en una región a sintetizar. En este caso, es posible que no se sintetice una cadena complementaria completa. El NASBA (amplificación basada en la secuencia de ácido nucleico, también denominado procedimiento de amplificación mediada por transcripción/TMA) se conoce como procedimiento de amplificar ácido nucleico en el que no es necesario el control complicado de la temperatura. El NASBA es un sistema de reacción en el que el ADN se sintetiza mediante la ADN polimerasa en presencia de un ARN diana como molde con una sonda que posea un promotor T7 añadido y el producto se forma con una segunda sonda en una cadena de doble hebra, seguido por la transcripción mediante la ARN polimerasa T7 con la cadena de doble hebra formada como molde para amplificar una gran cantidad de ARN (Nature, 350, 91-92, 1991). El NASBA requiera algunas etapas de desnaturalización térmica hasta que el ADN de doble hebra se completa, pero la posterior reacción de transcripción mediante ARN polimerasa T7 procede en condiciones isotérmicas. No obstante, es esencial una combinación de enzimas plurales tales como transcriptasa inversa, ARNasa H, ADN polimerasa y ARN polimerasa T7, y esto es desfavorable para un coste similar al SDA. Además, dado que es complicado establecer condiciones para una pluralidad de reacciones enzimáticas, este procedimiento apenas está extendido como procedimiento analítico general. En las reacciones conocidas de amplificación de ácido nucleico siguen existiendo problemas, tales como el control complicado de la temperatura y la necesidad de varias enzimas tal y como ya se ha descrito anteriormente. Para estas reacciones conocidas de sintetizar ácido nucleico, existen algunos informes sobre un intento de mejorar más la eficacia de la síntesis de ácido nucleico sin sacrificar la especificidad o el coste. Por ejemplo, en un procedimiento... [Seguir leyendo]

1. Un procedimiento para sintetizar ácido nucleico que está provisto en sus extremos 3 y 5 con una región que consta de una región nucleotídica complementaria a cada región terminal en la misma cadena y que tras la hibridación de estas secuencias nucleotídicas complementarias mutuamente forma un bucle capaz de aparear bases entre ellas, en el que el procedimiento comprende: i) la etapa de hibridarse a una región F2c en un ácido nucleico que sirva como molde, una región F2 en un oligonucleótido que comprende una región F2 y una región F1c, donde F1c está unida al extremo 5 de F2, y donde F2 es una región que posee una secuencia nucleotídica complementaria a una región arbitraria F2c en el ácido nucleico molde que posee una secuencia nucleotídica específica y F1c es una región que posee sustancialmente la misma secuencia nucleotídica que la región F1c localizada en el extremo 5 de la región F2c en el ácido nucleico molde que posee una secuencia nucleotídica específica, ii) la etapa de sintetizar un primer ácido nucleico que posea una secuencia nucleotídica complementaria al molde, en la que F2 en el primer oligonucleótido sirve como el origen de la síntesis, iii) la etapa de proporcionar una región arbitraria R2c en el primer ácido nucleico sintetizado en la etapa ii) lista para el apareamiento de bases, en la que la etapa se lleva a cabo mediante la síntesis por desplazamiento de hebras de una cadena complementaria mediante una polimerasa que cataliza la reacción por desplazamiento de hebras, en la que un cebador externo que hibrida con el extremo 3 de F2c en el molde sirve como el origen de la síntesis, iv) la etapa de hibridarse a una región R2c en el primer ácido nucleico en la etapa iii), un oligonucleótido que posea una región R2 y una región R1c, en la que R1c está unida al extremo 5 de R2, y en la que R2 es una región que tiene una secuencia nucleotídica complementaria a la de la región R2c en el primer ácido nucleico que tiene una secuencia de ácidos nucleicos específica, y R1 es una región que tiene sustancialmente la misma secuencia de nucleótidos en la región R1c localizada en el extremo 5 de la región R2c en el primer ácido nucleico que tiene una secuencia de ácidos nucleicos específica v) la etapa de sintetizar un segundo ácido nucleico con dicho oligonucleótido como el origen de síntesis. vi) la etapa de proporcionar F1 en el terminal 3 del segundo ácido nucleico listo para el apareamiento de bases, en la que la etapa se lleva a cabo mediante la síntesis desplazamiento por hebra de una cadena complementaria mediante una polimerasa que cataliza la reacción por desplazamiento por hebra, donde un cebador externo, que hibrida con el extremo 3' de R2c en el primer ácido nucleico, sirve como el origen de la síntesis, y vii) la etapa de síntesis de ácido nucleico de una cadena complementaria a partir del bucle formado por hibridación intramolecular de la región F1 terminal de 3, donde la síntesis de la cadena complementaria se inicia cuando el oligonucleótido que comprende una región F2 se hibrida al bucle en el terminal 3. 2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la temperatura de fusión de cada oligonucleótido y su región complementaria en el molde usado en la reacción se encuentra en la relación siguiente con la misma rigurosidad: (cebador externo/región en el extremo 3 en el molde) (F2c/F2 y R2c/R2) (F1c/F1 y R1c/R1). 3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 ó 2, en el que el ácido nucleico que sirve como molde es ARN, y la síntesis de cadena complementaria en la etapa ii) se realiza mediante una enzima que posee una actividad de transcriptasa inversa. 4. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera reivindicación 1 a 3, en el que la reacción por desplazamiento de hebra de síntesis de cadena complementaria se lleva a cabo en presencia de un regulador de la temperatura de fusión. 5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4, en el que el regulador de la temperatura de fusión es betaína. 6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que se permite la presencia en la solución de la 38   reacción de betaína 0,2 - 3,0M. 7. Un procedimiento para sintetizar ácido nucleico que está provisto en su terminal 3: con una región F1 capaz de hibridarse a una parte de F1c en la misma cadena y que tras la hibridación de la región F1 a f1c, es capaz de formar un bucle que contiene una región F2c capaz de aperear las bases, donde el procedimiento comprende: i) la etapa de hibridarse a una región F2c en un ácido nucleico que sirva como molde, una región F2 en un oligonucleótido que comprende una región F2 y una región F1c, en la que F1c está unida al extremo 5 de F2, y donde F2 es una región que posee una secuencia nucleotídica complementaria a una región arbitraria F2c en el ácido nucleico molde que posee una secuencia nucleotídica específica y F1c es una región que posee sustancialmente la misma secuencia nucleotídica que la región F1c localizada en el extremo 5 de la región F2c en el ácido nucleico molde que posee una secuencia nucleotídica específica, ii) la etapa de sintetizar un primer ácido nucleico que posea una secuencia nucleotídica complementaria al molde, en la que F2 en el primer oligonucleótido sirve como el origen de la síntesis, iii) la etapa de proporcionar una región arbitraria en el primer ácido nucleico sintetizado en la etapa ii) lista para el apareamiento de bases, en la que la etapa se lleva a cabo mediante la síntesis por desplazamiento de hebras de una cadena complementaria mediante una polimerasa que cataliza la reacción por desplazamiento de hebras, en la que un cebador externo que hibrida con el extremo 3 de F2c en el molde sirve como el origen de la síntesis, iv) la etapa de hibridarse a un oligonucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos complementaria a la región lista para el apareamiento de bases en el primer ácido nucleico en la etapa iii), seguido de una síntesis de un segundo ácido nucleico con dicho oligonucleótido como el origen de la síntesis, y v) la etapa de que proporciona F1 en el terminal 3 del segundo ácido nucleico listo para el apareamiento de bases, en la que la etapa se lleva a cabo mediante la síntesis desplazamiento por hebra de una cadena complementaria mediante una polimerasa que cataliza la reacción por desplazamiento por hebra, donde un cebador externo, que hibrida con el extremo 3' de la región usada como el origen de síntesis en la etapa iv) en el primer ácido nucleico, sirve como el origen de la síntesis, y vi) la etapa de síntesis de ácido nucleico de una cadena complementaria a partir del bucle formado por hibridación intramolecular de la región F1 terminal de 3, en la que la síntesis de la cadena complementaria se completa cuando la reacción alcanza R1, síntesis de la cadena complementaria se inicia cuando el oligonucleótido que comprende una región F2 se hibrida al bucle en el terminal 3. 8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7, en el que el ácido nucleico que sirve como el molde es ARN, y la síntesis de la cadena complementaria en la etapa ii) se lleva a cabo por una enzima que tiene una actividad de transcriptasa inversa. 9. El procedimiento de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 7 u 8, en el que la reacción por desplazamiento de hebra de la síntesis de la cadena complementaria se lleva a cabo en la presencia de un regulador para la temperatura de fusión. 10. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 9, en el que el regulador para la temperatura de fusión betaína. 11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10, en el que se permite que betaína 0,2 - 3,0 M. esté presente en la solución de reacción. 39   Fig. 1   41   42   43   44     46   47   48   49     51   52   53   54     56   57