Procedimiento de preparación y purificación de fosfatidilserina.

Procedimiento de separación y purificación de fosfatidilserina (PS) de fórmula en la que R1 y R2 representan independientemente un acilo C10-C30, saturado, mono-insaturado o poliinsaturado, X≥OH u OM, en la que M ≥ metal alcalino o alcalinotérreo, amonio, alquilamonio

(incluyendo la sal interna) de serina en forma D, L o racémica, a partir de un compuesto de fórmula en la que R1 y R2 y X tienen los significados especificados anteriormente, R3≥CH2-CH2-NH2 o CH2-CH2-N+(CH3)3 y de una enzima fosfolipasa D (PLD) que queda en un medio en el que la reacción de transfofatidilación ha tenido lugar, estando dicho medio seleccionado de:

-un medio hidroalcohólico que contiene un alcohol alifático y en presencia de óxido de metal bivalente;

-un medio aprótico que consiste en disolventes acuosos/polares y en presencia de un óxido de metal bivalente; o

un sistema de dos fases formado por disolvente acuoso/orgánico y en presencia de un óxido de metal bivalente, implicando dicho procedimiento las siguientes etapas:

I) añadir una solución salina de cloruro de sodio al medio de reacción que contiene la PS que se ha producido, con la subsiguiente mezcla y separación de la PS;

II) recogida y eliminación del sobrenadante;

III) las etapas I y II pueden repetirse modificando la concentración de partida de solución de cloruro de sodio y eliminando el sobrenadante;

IV) añadir una solución de EDTA para quelar los iones presentes en la solución y la mezcla subsiguiente;

V) añadir una solución de etanol que consiste en etanol en un porcentaje del 50 al 100 % o una mezcla de agua/acetona que consiste en acetona a un porcentaje del 50 al 95 % con mezclado y sedimentación de la PS subsiguientes;

VI) la etapa V se puede repetir modificando el porcentaje de etanol;

VII) añadir una solución de etanol que consiste en etanol a un porcentaje del 90 al 100 %;

VIII) recogida y eliminación del sobrenadante;

IX) secado del producto final.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E11171047.

Solicitante: FIDIA FARMACEUTICI S.P.A..

Nacionalidad solicitante: Italia.

Dirección: VIA PONTE DELLA FABBRICA 3/A 35031 ABANO TERME (PD) ITALIA.

Inventor/es: VACCARO, SUSANNA, ZANELLATO,ANNA,MARIA, PITTARELLO,Mara, GAMBILLARA,Antonio.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Preparaciones medicinales caracterizadas por los... > A61K47/48 (estando el ingrediente no activo químicamente unido al ingrediente activo, p. ej. conjugados polímero-medicamento)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > USO ESPECIFICO DE COSMETICOS O DE PREPARACIONES SIMILARES... > A61Q19/00 (Preparaciones para el cuidado de la piel)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > C12P9/00 (Preparación de compuestos orgánicos que contienen un metal o un átomo distinto al H, N, C, O, S o halógeno)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Cosméticos o preparaciones similares para el aseo > A61K8/14 (Liposomas)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > ALIMENTOS O PRODUCTOS ALIMENTICIOS; SU TRATAMIENTO,... > COMPOSICIONES A BASE DE PROTEINAS PARA LA ALIMENTACION;... > A23J7/00 (Composiciones a base de fosfátidos para la alimentación, p. ej. lecitina)
  • SECCION A — NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA > CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE > PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO... > Cosméticos o preparaciones similares para el aseo > A61K8/55 (que contienen fosforo)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P13/06 (Alanina; Leucina; Isoleucina; Serina; Homoserina)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > QUIMICA ORGANICA > COMPUESTOS ACICLICOS, CARBOCICLICOS O HETEROCICLICOS... > Compuestos que contienen elementos de los grupos... > C07F9/10 (Fosfátidos, p. ej. lecitina)

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Procedimiento de preparación y purificación de fosfatidilserina.
Procedimiento de preparación y purificación de fosfatidilserina.
Procedimiento de preparación y purificación de fosfatidilserina.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento de preparación y purificación de fosfatidilserina Objeto de la invención

La presente invención se refiere a procedimientos de purificación de fosfatidilserina (PS), para obtener el producto final con un alto rendimiento por medio de óxidos de metales bivalentes (BMO).

Campo de la invención

El declive funcional del Sistema Nervioso Central (SNC) que ocune durante el proceso fisiológico del envejecimiento cerebral, causa frecuentemente el deterioro de las funciones cognitivas en las personas mayores, lo que a su vez puede provocar trastornos de conducta y alteraciones de la memoria temporal y espacial.

Este declive funcional en la actividad del SNC está vinculado tanto con la aparición de alteraciones bioquímicas y estructurales en la composición lipídica de las membranas neuronales como con la disminución de la actividad de las enzimas cerebrales que puede reducir las sinapsis neuronales.

La fosfatidilserina (PS) es el principal fosfolípido ácido en el cerebro. Por lo tanto, la investigación científica se ha centrado durante algún tiempo en la búsqueda de un tratamiento farmacológico para los trastornos cognitivos relacionados con la edad, basado en fosfolípidos, que pueda evitar (y/o reconstruir parcialmente) el déficit estructural y funcional de las membranas neuronales envejecidas.

Estudios preclínicos y clínicos en seres humanos han demostrado que la administración de PS por vía oral, especialmente en los ancianos, puede determinar un incremento significativo en la capacidad de aprendizaje y la memoria temporal y espacial, incluso en el caso de patologías particularmente discapacitantes tales como la enfermedad de Alzheimer (Cenacchi T. et al.; Aging Clin Exp Res, 1993, 5: 123-133; Nunzi MG et al.; Adv Exp Med Biol, 1992; 318: 393- 8).

Además, se ha demostrado que la fosfatidilserina es capaz de combatir el incremento en la hormona cortisol en sujetos sometidos a estrés físico (Monteleone P. et al.; Neuroendocrinology, 1990, 52(3): 243-8), reduciendo de esta manera el catabolismo de la glucosa, con una mayor recuperación funcional después de un esfuerzo físico intenso.

La presente invención se refiere a un procedimiento de síntesis y purificación de PS y al uso de PS como el principio activo en fármacos (y/o suplementos alimenticios) para la prevención de las patologías relacionadas con la edad indicadas anteriormente y en la preparación de suplementos alimenticios indicados para todos los casos de estrés físico intenso y además, en la producción de liposomas para su uso en el campo de la cosmética y/o como un sistema de liberación controlada para los fármacos que contienen.

Los procedimientos de producción y purificación de PS, ya conocidos en la literatura científica y en patentes describen la conversión enzimática de fosfatidilcolina (PC) en PS mediante una reacción de transfosfatidilación catalizada por la enzima fosfolipasa D (PLD), con la subsiguiente purificación realizada principalmente mediante la extracción de la PS con disolventes orgánicos.

En los últimos años, se han perfeccionado diversos procedimientos para sintetizar PS mediante conversión enzimática en sistemas de dos fases de agua/disolvente orgánico o en un medio acuoso.

El documento EP 0776976 describe un procedimiento de preparación enzimática de PS en un sistema que consiste en agua/tolueno en el que la fase orgánica contiene el fosfolípido de partida a partir del que se forma la PS, la fase acuosa contiene el aceptar hidroxi y la reacción de síntesis ocurre en la interfaz agua/disolvente, en presencia de fosfolipasa D en bruto a partir de caldos de fermentación de cepas de microorganismos que producen PLD.

Por primera vez, en 1990, los investigadores trataron de eludir el sistema de dos fases ya que requería grandes cantidades de disolvente que luego eran difíciles de eliminar, con los altos costos correspondientes para la producción y la purificación de PS (Comfurius P. et al., Journal of Lipid Research 1990, 31: 1719-1721).

Por lo tanto el disolvente orgánico se sustituyó por un detergente/tensioactivo capaz de dispersar el fosfolípido de partida en forma micelar con el objetivo de realizar la reacción enzimática de síntesis exclusivamente en un medio acuoso.

De hecho, el documento EP 1048738 se refiere a un procedimiento de síntesis enzimática de PS en un medio acuoso absolutamente libre de cualquier contaminación por disolventes orgánicos, en presencia de concentraciones determinadas de detergentes específicos y sales de calcio.

El documento DE 19917249 describe un procedimiento de producción enzimática de PS en un medio acuoso sin usar

tensioactivos, exclusivamente con la adición de sal de cloruro de calcio (CaCh), sin embargo, no se especifican el porcentaje de conversión enzimática ni el grado de pureza de la PS obtenida.

El documento EP 1310563 describe un procedimiento de preparación de PS en una fase acuosa sin usar detergentes y/o sales de calcio, basado en la homogeneización de la mezcla de partida que consiste en fosfolípido, aceptor hidroxi y PLD en agua, para proporcionar un homogeneizado final con una estructura similar a la de una membrana de fosfolípidos bi- laminar en la que subsiguientemente puede ocunir la reacción de transfosfatidilación.

El documento EP 1427839 describe la síntesis enzimática de fosfolípidos, incluyendo PS, en agua, sin detergentes, pero en presencia de iones metálicos que se liberan desde las sales conespondientes cuando las mismas se preparan/disuelven en agua. Dicho procedimiento ocune en dos fases distintas en las que, a partir de mezclas de fosfolípidos, una primera reacción de hidrólisis enzimática se cataliza por PLD para producir ácido fosfatídico, seguida por una segunda reacción de transfosfatidilación en la que se forma PS en presencia de un exceso de serina.

Por último, el documento EP 1231213 reivindica un procedimiento de síntesis enzimática de PS usando, en agua, una fracción de la enzima PLD producida y purificada a partir de la cepa Streptovertidllium hachijoense para un rendimiento más abundante en la producción final de PS.

En relación a la purificación de PS (obtenida por transfosfatidilación en un medio acuoso/disolvente orgánico o en un medio acuoso), el documento EP 1213294 reivindica un procedimiento de purificación basado en el uso de una mezcla que consiste en agua/disolvente orgánico polar (tal como isopropanol) para extraer el fosfolípido indicado anteriormente de la solución que lo contiene, que a su vez se representa por un disolvente hidrocarbonado (tal como tolueno), mientras que el documento EP 0922707 se refiere a un procedimiento de extracción/purificación de PS a partir de una mezcla de fosfolípidos usando un sistema difásico de disolventes orgánicos, tales como heptano y metanol.

La presente invención se refiere a procedimientos de purificación de la fosfatidilserina (PS) que proporcionan el producto final en un rendimiento muy alto.

Además, el procedimiento de transfosfatidilación catalizado por la enzima PLD, permite que un alto porcentaje de PC se convierta en PS independientemente del medio en el que se produzca la reacción enzimática.

Descripción detallada de la invención

La patente EP 1890 706 divulga un procedimiento de preparación de PS (Fórmula I), en el que se realiza una transfosfatidilación mediante la enzima PLD, en presencia de BMO, alcanzando así la transferencia de un resto de fosfatidilo desde fosfatidilcolina (PC) (Fórmula II) a serina (que en este caso representa el aceptor hidroxi); esta reacción enzimática proporciona la conversión de PC en PS en un grado muy alto, independientemente del medio en el que ocurre la reacción enzimática.... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento de separación y purificación de fosfatidilserina (PS) de fórmula

ch2or`

I

CHOR2

CH20-P(=0)-0CH2-CH(NH2)-C00H

X

en la que R1 y R2 representan independientemente un acilo C10-C30, saturado, mono-insaturado o poliinsaturado, X=OH u OM, en la que M = metal alcalino o alcalinotérreo, amonio, alquilamonio (incluyendo la sal interna) de serina en forma D, L o racémica, a partir de un compuesto de fórmula

ch2or'

I

CHOR2

CH20-P(0)-OR3

X

en la que R1 y R2 y X tienen los significados especificados anteriormente, R3=CH2-CH2-NH2 o CH2-CH2-N+(CH3)3 y de una enzima fosfolipasa D (PLD) que queda en un medio en el que la reacción de transfofatidilación ha tenido lugar, estando dicho medio seleccionado de:

-un medio hidroalcohólico que contiene un alcohol alifático y en presencia de óxido de metal bivalente;

-un medio aprótico que consiste en disolventes acuosos/polares y en presencia de un óxido de metal bivalente; o un sistema de dos fases formado por disolvente acuoso/orgánico y en presencia de un óxido de metal bivalente,

implicando dicho procedimiento las siguientes etapas:

I) añadir una solución salina de cloruro de sodio al medio de reacción que contiene la PS que se ha producido, con la subsiguiente mezcla y separación de la PS;

II) recogida y eliminación del sobrenadante;

III) las etapas I y II pueden repetirse modificando la concentración de partida de solución de cloruro de sodio y eliminando el sobrenadante;

IV) añadir una solución de EDTA para quelar los iones presentes en la solución y la mezcla subsiguiente;

V) añadir una solución de etanol que consiste en etanol en un porcentaje del 50 al 100 % o una mezcla de agua/acetona que consiste en acetona a un porcentaje del 50 al 95 % con mezclado y sedimentación de la PS subsiguientes;

VI) la etapa V se puede repetir modificando el porcentaje de etanol;

Vil) añadir una solución de etanol que consiste en etanol a un porcentaje del 90 al 100 %;

VIII) recogida y eliminación del sobrenadante;

IX) secado del producto final.

2. Procedimiento de separación y purificación de fosfatidilserina (PS) de fórmula

ch2or'

I

CHOR2

CH20-P(=0)-0CHrCH(NH2)-C00H

X

en la que R1 y R2 representan independientemente un acilo C10-C30, saturado, mono-insaturado o poliinsaturado,

X=OH u OM, en la que M = metal alcalino o alcalinotérreo, amonio, alquilamonio (incluyendo la sal interna) de serina en forma D, L o racémica, a partir de un compuesto de fórmula

ch2or'

I

CHOR2

CH20-P(=0)-0R3

X

en la que R1 y R2 y X tienen los significados especificados anteriormente, R3=CH2-CH2-NH2 o CH2-CH2-N+(CH3)3 y de una enzima fosfolipasa D (PLD) que queda en un medio en el que la reacción de transfofatidilación ha tenido lugar, estando dicho medio seleccionado de:

-un medio hidroalcohólico que contiene un alcohol alifático y en presencia de óxido de metal bivalente;

-un medio aprótico que consiste en disolventes acuosos/polares y en presencia de un óxido de metal bivalente; o -un sistema de dos fases formado por disolvente acuoso/orgánico y en presencia de un óxido de metal bivalente,

implicando dicho procedimiento las siguientes etapas:

I) añadir una solución salina de cloruro de sodio a la PS que se ha filtrado previamente, con el subsiguiente mezclado y separación de la PS;

II) recogida y eliminación del sobrenadante;

III) las etapas I y II pueden repetirse modificando la concentración de partida de solución de cloruro de sodio y eliminando el sobrenadante;

IV) añadir una solución de EDTA para quelar los iones presentes en la solución y la mezcla subsiguiente;

V) añadir una solución de etanol que consiste en etanol en un porcentaje del 50 al 100 % o una mezcla de agua/acetona que consiste en acetona a un porcentaje del 50 al 95 % con mezclado y sedimentación de la PS subsiguientes;

VI) la etapa V se puede repetir modificando el porcentaje de etanol;

Vil) añadir una solución de etanol que consiste en etanol a un porcentaje del 90 al 100 %;

VIII) recogida y eliminación del sobrenadante;

IX) secado del producto final.

3. Procedimiento de separación y purificación de fosfatidilserina (PS) de fórmula

CHiOR1

I

CHOR2

I

CH20-P(=0)-0CH2-CH(NH2)-C00H

X

en la que R1 y R2 representan independientemente un acilo C10-C30, saturado, mono-insaturado o poliinsaturado, X=OH u OM, en la que M = metal alcalino o alcalinotérreo, amonio, alquilamonio (incluyendo la sal interna) de serina en forma D, L o racémica, a partir de un compuesto de fórmula

ch2or'

I

CHOR2

CH20-P(0)-OR3

X

en la que R1 y R2 y X tienen los significados especificados anteriormente, R3=CH2-CH2-NH2 o CH2-CH2-N (CH3)3 y de una enzima fosfolipasa D (PLD) que queda en un medio en el que la reacción de transfofatidilación ha tenido

lugar, estando dicho medio seleccionado de:

-un medio hidroalcohólico que contiene un alcohol alifático y en presencia de óxido de metal bivalente;

-un medio aprótico que consiste en disolventes acuosos/polares y en presencia de un óxido de metal bivalente; o -un sistema de dos fases formado por disolvente acuoso/orgánico y en presencia de un óxido de metal bivalente,

implicando dicho procedimiento las siguientes etapas:

I) añadir una solución salina de cloruro de sodio al medio de reacción que contiene la PS que se ha producido, con la subsiguiente mezcla y separación de la PS;

II) recogida y eliminación del sobrenadante;

III) añadir una solución salina de cloruro de sodio y llevar a cabo ultraflltraclón a través de una membrana porosa;

IV) secar el producto final.

4. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 en el que dicho medio de reacción es un medio hidroalcohólico y los alcoholes están seleccionados de metanol, etanol, n-propanol, isopropanol.

5. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 4 en el que el alcohol alifático es isopropanol en una concentración entre el 0,1 y el 50 %, expresada como % en volumen sobre el volumen del tampón de partida.

6. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 5, en el que la concentración de isopropanol es del 10 %.

7. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 en el que dicho medio de reacción contiene un disolvente polar aprótico seleccionado de dlmetllsulfóxido, acetonltrllo, dimetllformamlda y N-metli-pirrolidona.

8. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 7 en el que el disolvente polar aprótico es dlmetilsulfóxido en una concentración entre el 0,1 y el 50 % expresada como un % en volumen sobre el volumen del tampón de partida.

9. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 8 en el que la concentración de dlmetllsulfóxido es del 1,25 %.

10. Un procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones 1-3 en el que dicho medio de reacción es un sistema de dos fases formado por disolvente acuoso/orgánico en el que los disolventes orgánicos están seleccionados de n- hexano, tolueno, benceno y n-butanol.

11. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 10 en el que el disolvente orgánico es n-hexano en una concentración entre el 0,1 y el 40 % expresada como % en volumen sobre el volumen del tampón de partida.

12. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11 en el que la concentración de n-hexano es del 1,25 % o del 2,5 %.

13. El procedimiento de acuerdo con las reivindicaciones anteriores 1-12 en el que el óxido de metal bivalente es óxido de calcio o de magnesio o de cinc en una concentración de entre 0,1 y 1 M.

14. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 13 en el que la concentración de los óxidos seleccionados es 0,33 o 0,54 M.