PROCEDIMIENTO DE DETECCION DE VIRUS DE GRIPE.
Un procedimiento de detección rápida de virus y/o partículas víricas de la gripe que comprende un componente hemaglutinina y un componente neuraminidasa,
comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
a) la unión de virus y/o partículas víricas a un soporte que contiene al menos un tipo de receptor de carbohidrato seleccionado del grupo constituido por oligosacáridos naturales o sintéticos, que está conjugado a, o situado en una composición con glicoproteínas cuyo receptor de carbohidrato se une al componente hemaglutinina de los virus y/o partículas víricas;
b) la reacción del componente neuraminidasa de los virus y/o partículas víricas unidos con su sustrato enzimático marcado, que causa la generación de una señal detectable; y
c) la detección de la señal generada en la etapa b)
Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2007/054835.
Solicitante: VETERINARMEDIZINISCHE UNIVERSITAT WIEN.
Nacionalidad solicitante: Austria.
Dirección: VETERINARPLATZ 1,1210 VIENNA.
Inventor/es: LEISER, ROBERT-MATTHIAS, BOVIN,NIKOLAY VLADIMIROVICH, LUBAVINA,IRINA ALEXANDROVNA.
Fecha de Publicación: .
Fecha Concesión Europea: 12 de Mayo de 2010.
Clasificación PCT:
- C12Q1/34 QUIMICA; METALURGIA. › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA. › C12Q PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS QUE INTERVIENEN ENZIMAS, ÁCIDOS NUCLEICOS O MICROORGANISMOS (ensayos inmunológicos G01N 33/53 ); COMPOSICIONES O PAPELES REACTIVOS PARA ESTE FIN; PROCESOS PARA PREPARAR ESTAS COMPOSICIONES; PROCESOS DE CONTROL SENSIBLES A LAS CONDICIONES DEL MEDIO EN LOS PROCESOS MICROBIOLOGICOS O ENZIMOLOGICOS. › C12Q 1/00 Procesos de medida, investigación o análisis en los que intervienen enzimas, ácidos nucleicos o microorganismos (aparatos de medida, investigación o análisis con medios de medida o detección de las condiciones del medio, p. ej. contadores de colonias, C12M 1/34 ); Composiciones para este fin; Procesos para preparar estas composiciones. › en los que interviene una hidrolasa.
- G01N33/569 FISICA. › G01 METROLOGIA; ENSAYOS. › G01N INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION DE SUS PROPIEDADES QUIMICAS O FISICAS (procedimientos de medida, de investigación o de análisis diferentes de los ensayos inmunológicos, en los que intervienen enzimas o microorganismos C12M, C12Q). › G01N 33/00 Investigación o análisis de materiales por métodos específicos no cubiertos por los grupos G01N 1/00 - G01N 31/00. › para microorganismos, p. ej. protozoarios, bacterias, virus.
Fragmento de la descripción:
Procedimiento de detección de virus de gripe.
La presente invención se refiere a un procedimiento de detección rápida de virus y/o partículas víricas de la gripe que comprenden un componente hemaglutinina y un componente neuraminidasa, dicho procedimiento comprende la unión de los virus y/o partículas víricas a un soporte mediante una molécula de unión específica, que se une al componente hemaglutinina de los virus y/o partículas víricas y que detecta a los virus y/o partículas víricas unidos mediante la reacción del componente neuraminidasa con su sustrato enzimático, que da como resultado una señal detectable. Adicionalmente se refiere a un sistema de detección para la detección rápida de virus y/o partículas víricas de la gripe que emplea el procedimiento según la invención y al uso del sistema de detección según la inven- ción.
Todos los virus de la gripe aviar (GA) son virus de la gripe de tipo A de la familia de los virus Orthomyxoviridae y todas las cepas conocidas del virus de la gripe A infectan a pájaros. Los virus de la gripe de tipo A se subdividen en subtipos en base a la proteína hemaglutinina (H) y neuraminidasa (N) que sale del núcleo central del virus. Existen 16 tipos de H y hasta 9 subtipos de N, dando 144 combinaciones potenciales diferentes de proteínas H y N.
La gripe aviar (también conocida como gripe de los pájaros, gripe aviar, gripe A del virus de la gripe, gripe de tipo A, o gripe de género A) es una gripe provocada por un tipo de virus de la gripe que tiene a los pájaros como huésped, pero que puede infectar a diversas especies de mamíferos.
Una pandemia de gripe es una epidemia a gran escala del virus de la gripe, tal como la gripe española de 1918. La Organización Mundial de la Salud (OMS) advierte de que existe un riesgo sustancial de una pandemia de gripe en los próximos años. Uno de los candidatos más probables es el subtipo A (H5N1) de la gripe aviar.
El H5N1 es un tipo de virus de la gripe aviar (virus de la gripe de los pájaros) que ha mutado por deriva antigénica en docenas de variantes altamente patógenas, pero todas ellas pertenecen actualmente al genotipo Z del virus de la gripe aviar H5N1. El genotipo Z surgió por redistribución en 2002 de genotipos previos altamente patógenos de H5N1 que apareció por primera vez en China en 1996 en pájaros y en Hong Kong en 1997 en seres humanos. Los virus H5N1 de infecciones en seres humanos y los virus aviares íntimamente relacionados aislados en 2004 y 2005 pertenecen a un solo genotipo, a menudo denominado genotipo Z.
Los subtipos de gripe aviar que se han confirmado en seres humanos, ordenados por el número de muertes humanas conocidas, son: el H1N1 que causó la gripe española, el H2N2 que causó la gripe asiática, el H3N2 que causó la gripe de Hong Kong, H5N1, H7N7, H9N2, H7N2, H7N3, H10N7.
Para poder responder rápidamente en caso de que aparezca una nueva cepa mutada y virulenta de gripe capaz de transmitirse de humano a humano se requiere un procedimiento de ensayo rápido y fiable para determinar si un animal o una persona están infectados con el virus. Los procedimientos de laboratorio actuales para la detección de virus a partir de muestras medioambientales, animales, y de pacientes son laboriosos y requieren tiempo.
El documento US-B-6.503.745 divulga compuestos de ciclopentano y de ciclopenteno suministrados junto con su uso en un procedimiento para la detección del virus de la gripe. El virus es capturado usando una superficie recubierta de fetuína y la detección se lleva a cabo con un compuesto marcado que se une a neuraminidasa.
D.E. Noyola y col. informan en el Journal of Clinical Microbiology, 2000, p. 1161-1165 sobre perlas recubiertas con fetuína. La fetuína también actúa como sustrato para la neuraminidasa, y la detección se lleva a cabo usando aglutinación.
El documento US-A-2003/0129618 divulga procedimientos y composiciones para la detección de analitos usando la fluorescencia que se produce en un material polimérico en respuesta a la unión selectiva de analitos a materiales poliméricos. En particular, la presente invención permite la detección fluorescente de reacciones que modifican la membrana y de analitos responsables de esas modificaciones y la selección de los inhibidores de acción.
El documento US-B-6.503.745 divulga ciclopentano y compuestos de ciclopenteno y su uso en un procedimiento para la detección del virus de la gripe.
Todas las soluciones rápidas in situ conocidas y accesibles se basan en el uso de anticuerpos contra epítopos virales o en simples pruebas para la neuraminidasa (NA). La principal desventaja de las soluciones con anticuerpos basados en una técnica de flujo lateral u otros tipos de ensayo es la inestabilidad de los reactivos anticuerpos. Además, la mayoría de ensayos inmunológicos disponibles hasta la fecha muestran una especificidad por la gripe A, pero no por H5N1. Adicionalmente, el uso de anticuerpos conduce irremediablemente a un incremento de los costes del ensayo.
La principal desventaja de las pruebas de NA específicas para los virus de la gripe es el caro reactivo del sustrato necesario usado en el estado de la técnica, que debe estar parcialmente metilado.
La presente invención soluciona estos problemas proporcionando un procedimiento para la detección rápida de virus y/o partículas víricas de la gripe, un sistema de detección que emplea dicho procedimiento así como el uso de dicho sistema de detección como se define en las reivindicaciones.
En la memoria descriptiva se usarán las siguientes abreviaturas:
3'SLN = Neu5Aca2-3Galß1-4GlcNAc
HA = hemaglutinina;
HAR = reacción de hemaglutinación;
LOD = limite de detección;
NA = neuraminidasa;
TCID = dosis infecciosa para un cultivo tisular;
Tampón TN = tris-HCl 0,02 M (pH 7,2) con NaCl 0,1 M.
Según la invención se emplea un procedimiento de detección rápida de virus y/o partículas víricas de la gripe, el procedimiento que comprende las etapas de:
a) la unión de virus y/o partículas víricas a un soporte que contiene al menos un tipo de receptor de carbohidrato seleccionado del grupo constituido por oligosacáridos naturales o sintéticos, que está conjugado a, o situado en una composición con glicoproteínas como la glicoforina, la a1-glicoproteína ácida, la a2-macroglobulina, el ovomucoide, y sus combinaciones cuyo receptor de carbohidrato se une al componente hemaglutinina de los virus y/o partículas víricas;
b) la reacción del componente neuraminidasa de los virus y/o partículas víricas unidos con su sustrato enzimático marcado, que causa la generación de una señal detectable; y
c) la detección de la señal generada en la etapa b).
En particular, se detectan virus y/o partículas víricas de la gripe que comprenden todos los subtipos conocidos de gripe aviar (IA).
En otra forma de realización de la invención los virus y/o partículas víricas de la gripe comprenden un cierto subtipo o grupo de subtipos. El procedimiento es adecuado para detectar virus y/o partículas víricas de la gripe que comprenden una variante altamente patógena.
La invención se puede realizar en particular con un soporte que es un papel o membrana cromatográficos. Esos materiales son muy conocidos por la persona experta en la materia. Según la invención es posible unir covalentemente o adsorber físicamente el receptor de carbohidrato, como se ha mencionado anteriormente, al soporte.
En particular, la invención emplea un receptor de carbohidrato que contiene el motivo a2-3Gal. Según una forma de realización de la invención (solución con transferencia de manchas) la unión de los virus y/o partículas víricas se lleva a cabo cargando una muestra que contiene los virus y/o partículas víricas en el soporte en forma de punto. Según la invención la unión de los virus y/o partículas víricas se lleva a cabo poniendo en remojo una muestra que contiene los virus y/o partículas víricas a lo largo de dicho soporte en forma de la denominada aproximación de flujo lateral. En otra forma de realización de la invención un sustrato enzimático marcado del componente neuraminidasa se precipita en el sitio del virus y/o partículas víricas unidos.
En otra forma de realización más de la presente invención, el sustrato enzimático está marcado con un grupo cromógeno y la reacción con una neuraminidasa induce un cambio de color de dicho sustrato enzimático. Como sustratos...
Reivindicaciones:
1. Un procedimiento de detección rápida de virus y/o partículas víricas de la gripe que comprende un componente hemaglutinina y un componente neuraminidasa, comprendiendo dicho procedimiento las etapas de:
2. El procedimiento de la reivindicación 1 en el que la glicoproteína se selecciona del grupo constituido por glicoforina, la a1-glicoproteína ácida, la a2-macroglobulina, el ovomucoide, y sus combinaciones.
3. El procedimiento según la reivindicación 1 ó 2 en el que dichos virus y/o partículas víricas de la gripe comprenden un cierto subtipo o un grupo de subtipos, en particular todos los subtipos conocidos de gripe aviar (GA).
4. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que dichos virus y/o partículas víricas de la gripe comprenden una variante altamente patógena.
5. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 4, en el que el soporte es un papel o una membrana cromatográficos.
6. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, en el que el receptor de carbohidrato, en particular cuando el receptor de carbohidrato contiene el motivo a2-3Gal, está unido covalentemente o adsorbido físicamente al soporte.
7. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 6, en el que dicha unión de dichos virus y/o partículas víricas se lleva a cabo cargando una muestra que contiene virus y/o partículas víricas a dicho soporte como un punto, o en el que dicha unión de dichos virus y/o partículas víricas se lleva a cabo poniendo en remojo una muestra que contiene virus y/o partículas víricas a lo largo de dicho soporte.
8. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, en el que dicho sustrato enzimático marcado de dicho componente neuraminidasa se precipita en el sitio del virus y/o partículas víricas unidos.
9. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, en el que dicho sustrato enzimático está marcado con un grupo cromógeno y la reacción con la neuraminidasa induce un cambio de color de dicho sustrato enzimático, en particular dicho sustrato enzimático es un derivado cromógeno del ácido N-acetilneuramínico, en particular, el ácido 5-bromo-4-cloro-3-indolil-a-N-acetilneuramínico.
10. El procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la reacción con la neuraminidasa induce una señal de fluorescencia específica.
11. Un sistema de detección para la detección rápida de virus y/o partículas víricas de la gripe usando un procedimiento según cualquiera de las reivindicaciones 1-10, comprendiendo dicho sistema:
12. El sistema de detección según la reivindicación 11, en el que dicho soporte está encerrado en un contenedor de plástico con una ventana para la lectura de los resultados de la prueba con una muestra y un control positivo.
13. El sistema de detección según la reivindicación 11 y/o 12, en el que dicho soporte comprende al menos dos cantidades diferentes de dichos agentes aglutinantes específicos para la estimación semi-cuantitativa del contenido en virus de la muestra.
14. El sistema de detección según la reivindicación 11 a 13, en el que dicho soporte comprende al menos dos receptores específicos de diferente especificidad de subtipo para una detección simultánea de virus que pertenecen a subtipos diferentes.
15. El sistema de detección según cualquiera de las reivindicaciones 11-14, en el que el sistema, después de revelar la presencia del virus y/o partículas víricas de especificidad buscada, sirve como unidad contenedora y de transporte de la muestra para pruebas confirmatorias como la reacción en cadena de la polimerasa de transcripción inversa.
16. Uso del sistema de detección según cualquiera de las reivindicaciones 11 a 15 para la detección del virus y/o partículas víricas de la gripe en muestras de animales y/o seres humanos como frotis, heces y sangre, en muestras del entorno y/o como un sistema de alerta temprana de la emergencia de subtipos de virus altamente patógenos.
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