Procedimiento para la crioconservación de células, construcciones de células artificiales o ensamblajes tridimensionales de tejidos complejos.

Procedimiento para la crioconservación y almacenamiento a largo plazo de uno o varios tipos de células,

construcciones celulares o ensamblajes tridimensionales de tejidos complejos, que comprende:

a) Sembrar uno o varios tipos de células o diferentes tipos de células que conforman las construcciones de células o los ensamblajes de tejido tridimensional sobre un vehículo celular estable de colágeno que tiene un espesor de menos de 150 μm, una masa por unidad de área de 10 a 170 g / m2 y la siguiente composición:

i) colágeno [% en peso]: 30 a 80,

ii) nitrógeno de amida [% en peso]: de 0,06 a 0,7,

iii) poliol [% en peso]: de 0 a 50,

iv) lípidos [% en peso]: de 0 a 20,

v) agua [% en peso]: 5 a 40,

b) cultivar las células hasta su adhesión al vehículo celular de colágeno,

c) lavar las células no adherentes,

d) congelar el vehículo celular de colágeno con células adherentes en un medio de congelación.

Procedimiento para la crioconservación de células, construcciones de células artificiales o ensamblajes tridimensionales de tejidos complejos

Campo de la invención

La presente invención está en el campo de la crioconservación de cultivos de células y de tejidos, más específicamente se refiere a un procedimiento para la crioconservación y almacenamiento a largo plazo de células, construcciones de células o ensamblajes tridimensionales de tejidos complejos. El procedimiento se basa en el uso de un vehículo de células de colágeno que tiene una composición específica, así como un espesor muy específico y propiedades mecánicas adecuadas en las que se mantienen después de la descongelación. El uso de dicho vehículo celular de colágeno (CCC) proporciona un soporte muy adecuado para la crioconservación que resulta en tasas de supervivencia muy altas después del proceso de descongelación y proporciona células y ensamblajes de tejidos ya adheridos a un soporte mecánicamente estable y biocompatible.

La invención también se refiere a ensamblajes de células vehículo de colágeno congeladas y a construcciones de células artificiales congeladas o ensamblajes tridimensionales de tejidos complejos que pueden obtenerse mediante el procedimiento de la invención y al uso de los mismos después de la descongelación.

Antecedentes de la invención

Crioconservación

La crioconservación desempeña un papel importante en la conservación a corto y a largo plazo de las células y, por tanto, es de importancia central en los bancos de células y tejidos. Las células crioconservadas tales como las células madre hematopoyéticas humanas se han trasplantado con éxito para el tratamiento clínico de rutina de la leucemia durante décadas. Cada vez más se usan terapias basadas en células utilizando tejidos de bancos en otras áreas de la medicina regenerativa también. El gran potencial de estas aplicaciones crece a medida que nuevos hallazgos conducen a la generación de nuevos productos para el uso clínico.

Con la ayuda de la criotecnología se pueden disponer de suspensiones de células, células adherentes e incluso tejidos generados artificialmente "justo a tiempo" en los bancos de células. La implementación de este tipo de proyectos, sin embargo, requiere la disponibilidad de los tejidos regenerados basados en las células correspondientes, así como de los sistemas de crioconservación con la que se pueden producir células adherentes o ensamblajes de tejidos complejos y conservar en su forma tridimensional natural con un estrecho seguimiento, en condiciones producibles y rentables.

Con el fin de proteger a las células durante los procesos de congelación y descongelación, se añaden al medio de congelación productos químicos especiales, tales como dimetilsulfóxido (DMSO), trehalosa, glicerina o hidroxietil almidón (HES).

Estos llamados crio protectores protegen las células y sus orgánulos del daño en la membrana por los cristales de hielo y de la deshidratación intracelular durante la transición de agua desde la fase líquida a la fase cristalina. Se sabe que la congelación y la descongelación están asociadas con una pérdida de la vitalidad y de función en las células, dependiendo el grado de pérdida del tipo de célula que se está congelando. En los procedimientos convencionales, el dimetilsulfóxido se usa en concentraciones de hasta el 1 % (v/v) ya sea solo o en combinación con almidón de hidroxietilo. El DMSO funciona principalmente en el compartimento intracelular mediante la reducción del punto de congelación, lo que reduce la formación de cristales de hielo y, por lo tanto, reduce al mínimo la deshidratación celular durante la congelación. Por el contrario, la acción de macromoléculas tales como hidroxietilalmidón es extracelular mediante la formación de una envoltura protectora para las células y la prevención de la pérdida de líquido de las células durante la congelación.

Vehículos celulares

Además de los crioprotectores, el tipo correcto de vehículo celular es también de importancia principal en el proceso de crioconservación. Idealmente, su espesor debe ser aproximadamente el de las células que lo colonizan es decir, menos de 15 pin. Debido a su mayor capacidad de almacenamiento de calor, los vehículos celulares más gruesos pueden actuar como tampón, especialmente durante el proceso de congelación y descongelación, produciendo un gradiente de temperatura que afecta negativamente a las velocidades estándar de congelación o descongelación. La reproducibilidad y la normalización se vuelven aún más importantes cuando las células sensibles y caros, ensamblajes celulares complejo o tejidos regenerados basados en células deben conservarse. La velocidad de congelación o descongelación y la presión ambiente ayudan a determinar el grado hasta el cual tiene lugar la cristalización cuando se alcanza el punto de congelación. Además, debe tenerse en cuenta que la cristalización también puede tener lugar dentro del material de los vehículos celulares con una cierta capacidad para absorber fluidos. Los vehículos celulares más finos tienen la ventaja adicional de que los crioprotectores penetran rápidamente en el interior.

Se han utilizado varios materiales como vehículo celular para el cultivo de células y / o la crioconservación de células

o tejidos. El ácido hialurónico, alginato, agarosa, fibrina, quitina / chitosano, polilactida (PLA), poliglicólido (PGA) o ácido poli-L-láctico (PPLA) son algunos de los materiales conocidos en la técnica anterior como armazón o vehículo para el cultivo y / o la crloconservación de las células.

Los vehículos que contienen colágeno se han usado ampliamente como matriz para el cultivo de células, así como para la crloconservación de las mismas (documento WO 2759855 y McKay GC et al. Toxicology in vitro, vol. 16(1), 22:71-79). El colágeno es uno de los principales componentes en la estructura de los tejidos conectivos, por ejemplo, piel, vasos sanguíneos, ligamentos, tendones y el cartílago, y en las estructuras de los huesos y los dientes. Hasta la fecha, se han identificado más de 28 tipos diferentes de colágeno mostrando solo diferencias insignificantes entre las distintas especies. Este hecho, junto con el hecho de que la degradación de colágeno no produce ningún producto de degradación tóxico hace que el colágeno sea biocompatible y muy útil en medicina.

Sin embargo, los vehículos de células de colágeno utilizados hasta ahora para la crloconservación de células adherentes están normalmente en forma de hidrogeles, es decir, un material similar a la gelatina con alta viscosidad y un contenido de agua muy alto. Dichos hidrogeles a base de colágeno generalmente se han utilizado en diferentes conformaciones para la crioconservación. La conformación más habitual y simple es en monocapa, es decir, las células o los tejidos se siembran directamente en placas de cultivo recubiertas con una simple monocapa de gel de colágeno. Otra conformación ampliamente utilizado para la crioconservación de células o tejidos en los hidrogeles a base de colágeno es la conformación de tipo sándwich, es decir, las células se crioconservan entre dos capas de gel de colágeno.

Sin embargo, estos hidrogeles a base de colágeno tienen el inconveniente de que normalmente tienen espesores superiores a 15 pm que afectan negativamente a la vitalidad celular después de la descongelación por las razones explicadas antes. Además, los hidrogeles de colágeno puro no poseen suficiente estabilidad mecánica para permitir la transferencia controlada de la construcción en el organismo después de la descongelación.

El documento W2514774 da a conocer un hidrogel de colágeno para el cultivo de células preparadas secando completamente el hidrogel y mediante la rehidrolización de las mismas. La película divulgada en este documento tiene un espesor del orden de pm-1mm, sin embargo, el documento no menciona nada sobre la idoneidad de esta película para sufrir un proceso de crioconservación.

Por lo tanto, existe la necesidad de desarrollar procedimientos para la crioconservación de células, las construcciones de células o ensamblajes de tejidos complejos soportados por los portadores de células que tienen una estabilidad mecánica suficiente después de la descongelación. Esto permitiría, en el caso de la medicina regeneratlva, la Implantación directa e inmovilización de la construcción vehículo celular en el organismo dañado pero conservando al mismo tiempo el efecto beneficioso con respecto a la biocompatibilidad y degradabilidad ya conocidas para los vehículos de colágeno.

Todas las matrices de vehículo mecánicamente estables... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la crioconservación y almacenamiento a largo plazo de uno o varios tipos de células, construcciones celulares o ensamblajes tridimensionales de tejidos complejos, que comprende:

a) Sembrar uno o varios tipos de células o diferentes tipos de células que conforman las construcciones de células o los ensamblajes de tejido tridimensional sobre un vehículo celular estable de colágeno que tiene un espesor de menos de 15 pm, una masa por unidad de área de 1 a 17 g / m2 y la siguiente composición:

I) colágeno [% en peso]: 3 a 8,

ii) nitrógeno de amida [% en peso]: de ,6 a ,7,

iii) poliol [% en peso]: de a 5,

iv) lípidos [% en peso]: de a 2,

v) agua [% en peso]: 5 a 4,

b) cultivar las células hasta su adhesión al vehículo celular de colágeno,

c) lavar las células no adherentes,

d) congelar el vehículo celular de colágeno con células adherentes en un medio de congelación.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que un tipo o varios tipos de células que forman una construcción de célula deseada o ensamblajes de tejido tridimensionales se siembran en ambos lados del vehículo celular de colágeno.

3. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el colágeno del vehículo celular de colágeno está retlculado.

4. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el espesor del vehículo celular de colágeno es menor de 8 pm o menor de 4 pm.

5. Procedimiento según la reivindicación 1 o 2, en el que el colágeno es colágeno de tipo I o una mezcla de colágeno I y colágeno III o una mezcla de colágeno I y lo III con elastina.

6. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que los polioles son seleccionados de glicerol, etilengllcol, butenodloles, propenodloles, sorbitol u otros hexitoles, xilitol u otros pentitoles y mezclas de los mismos.

7. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que los lípidos son aceites vegetales.

8. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el vehículo celular de colágeno puede estar recubierto con proteínas estructurales de la matriz extracelular, preferiblemente lamininas, fibronectina, elastina o ácido hialurónico o con apatita o con moléculas funcionales seleccionados de factores de crecimiento, cltoqulnas, moléculas de orientación o anticuerpos.

9. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que el medio de congelación comprende dimetilsulfóxido (DMSO), trehalosa, glicerina o hldroxletllalmldón (HES).

1. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1 o 2, en el que las células adherentes son células eucarlotas o procariotas o células eucarlotas o procariotas genéticamente modificadas.

11. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que las células eucariotas son células vegetales, animales o fúngicas.

12. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 11, en el que las células animales son células de mamíferos, ya sea células primarias o células inmortalizadas, preferiblemente células humanas.

13. Procedimiento de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 a 12, en el que las células son seleccionadas de células madre tales como líneas de células madre embrionarias no humanas, células madre pluripotenciales inducidas, células madre mesenqulmatosas, células madre endoteliales, células madre hematopoyéticas, células madre neurales, células madre de la cresta neural o células madre gastrointestinales; células somáticas, tales como células endoteliales, células epiteliales de estómago e Intestino, células epiteliales mamarias, melanocltos, células epiteliales pulmonares, células epiteliales renales, queratlnocitos, células uroteliales, hepatocitos, células del cristalino de la córnea, osteoblastos, osteocitos, odontoblastos, condrocitos, células de ligamentos, células tendinosas, células de la hipófisis, células de las glándulas salivales, células de la glándula suprarrenal, células del páncreas exocrino y endocrino, células de Leydig, adipocitos, fibroblastos, células de la retina, neuronas dopaminérgicas, neuronas GABAérgicas, neuronas glutaminérgicas, neuronas colinérgicas, neuronas adrenérgicas, astrocitos, oligodendrocitos, células de Schwann, células de músculo liso, células de

músculo esquelético, cardiomiocitos, linfocitos B, linfocitos T, macrófagos, neutrófilos, células dendríticas, mastocitos, eosinófilos, basófilos, células asesinas naturales, células M o microglfa; células modificadas genéticamente; líneas celulares de cáncer, tales como HeLa, CCF-STTG1, Hep G2, SK-MEL-5, Saos-2 o WERI-Rb- 1; líneas celulares inmortalizadas como Nuli, CuFi, CFION-1, BJ-5ta, hTERT-FIME1 (ME16C), hTERT-FIPNE, 5 hTERT RPE-1, NeHepLxHT o células madre embrionarias humanas; células vegetales, tales como células de Brownanthus corallinus, Carpanthea pomeridiana, Conophytum meyerae, Delosperma ecklonis, Sesuvium portulacastrum, Sphalmanthus trichomotus, Amaranthus retroflexus, Pleuropetalum darwinii, Amaryllidaceae, Crinum x powellii hort., Catharanthus longifolius, Dictyophleba leonensis o Ervatamia coronaria; células fúngicas tales como Dacrymyces deliquescens, Fennellomyces linderi, Cunninghamella blakesleeana, Tolypocladium inflatum, 1 Radiomyces spectabilis, Wallemia sebi, Lophodermium seditiosum, Saccharomyces cerevisiae, Candida albicans, Debaromyces japonicus, Fellomyces polyborus, Brettanomyces abstinens, Hyphopichia burtonii o Kloeckera brevis; células bacterianas tales como Acidobacterium capsulatum, Escherichia coli, Saccharococcus thermophilus, Lactobacillus acidophilus, Bacillus thuringiensis, Pseudomonas aeruginosa o Enterococcus faecalis.

14. Ensamblaje de células-vehículo celular de colágeno o construcción celular artificial congelada o ensamblaje de 15 tejido complejo tridimensional obtenible mediante el procedimiento de la reivindicación 1 o 2, en el que el vehículo

celular de colágeno, el ensamblaje de células o la construcción celular artificial congelada o el ensamblaje de tejido complejo tridimensional presentan la misma estructura tridimensional después de la descongelación.

15. El ensamblaje de células-vehículo de colágeno descongelado, la construcción de célula artificial o el ensamblaje de tejido complejo tridimensional de acuerdo con la reivindicación 14 para uso en medicina regeneratlva.

16. Uso del ensamblaje células-vehículo de colágeno descongelado, construcción de célula artificial descongelada o

ensamblaje de tejido complejo tridimensional de acuerdo con la reivindicación 14 para la Investigación básica o para los sistemas de pruebas ¡n vitro tal como los sistemas de prueba de sustancias farmacológicas, productos químicos o cosméticos.