Procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos usando una PCR sobre microchip con detección integrada de CE en tiempo real.

Un procedimiento de amplificación y detección de ácidos nucleicos para un sistema microfluídico que comprende:

(1) proporcionar un sistema microfluídico que comprende:

un sustrato que tiene una cámara (220) para la amplificación de un volumen de ácido nucleico;

una pluralidad de pocillos (240) dispuestos sobre el sustrato;

canales (230) de flujo que conectan los pocillos (240) y la cámara (220) en el sustrato para permitir el flujo de la solución por la cámara; y

uno o más canales (200) de separación proporcionados en el sustrato que conectan la cámara y otros pocillos para separar y detectar una fracción del ácido nucleico amplificado en la cámara, estando configurados la cámara (220), los canales (230) de flujo y los uno más canales (200) de separación de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en las cámaras y los canales de flujo combinados sea al menos 103 veces menor que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación;

(2) disponer una solución de ácido nucleico en la cámara (220);

(3) amplificar el ácido nucleico dispuesto en la cámara (220);

(4) introducir desde la cámara (220) una fracción del ácido nucleico amplificado en los uno o más canales (200) de separación;

(5) separar la fracción del ácido nucleico amplificado mediante los uno o más canales (200) de separación; y

(6) detectar el ácido nucleico separado,

en el que las etapas (3) a (6) se repiten una o más veces, o la etapa (3) se repite una o más veces y después las etapas (4) a (6) se ejecutan una vez.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2008/007359.

Solicitante: WAKO PURE CHEMICAL INDUSTRIES, LTD.

Nacionalidad solicitante: Japón.

Dirección: 1-2, DOSHOMACHI 3-CHOME CHUO-KU OSAKA-SHI OSAKA 540-8605 JAPON.

Inventor/es: ZHANG,JIAN PING, BOUSSE,Luc.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/34 (Polinucleótidos, p. ej. ácidos nucleicos, oligorribonucleótidos)
  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > G01N30/00 (Investigación o análisis de materiales por separación en constituyentes utilizando la adsorción, la absorción o fenómenos similares o utilizando el intercambio iónico, p. ej. la cromatografía (G01N 3/00 - G01N 29/00 tienen prioridad))

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Procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos usando una PCR sobre microchip con detección integrada de CE en tiempo real.

Fragmento de la descripción:

Procedimiento de amplificación de ácidos nucleicos usando una PCR sobre microchip con detección integrada de CE en tiempo real

Campo de la invención La presente invención versa acerca de un procedimiento de amplificación y detección de ácidos nucleicos para un dispositivo microfluídico para llevar a cabo una reacción en cadena de la polimerasa de gran volumen (PCR) y la detección integrada en electroforesis capilar (CE) .

Antecedentes de la invención La PCR microfluídica se define generalmente como PCR en cámaras con dimensiones que son muy pequeñas, por ejemplo en el intervalo entre 500 y 0, 5 !m. Hay sistemas microfluídicos con diversos sistemas calefactores tales como la calefacción zonal, calefactores externos, resistencias integradas, calefacción de Joule y radiación infrarroja, pero esos sistemas requieren detección externa. Eso significa que, al final de la reacción, hay que retirar de la cámara de PCR parte de la muestra y analizarla fuera del sistema por medios tales como la electroforesis en gel o la electroforesis capilar. Se describen ejemplos de trabajo de este tipo en Cheng et al. Nucleic Acids Res, 24 (2) , p. 380-5 (1996) ; Kopp y Manz, Science, 280 (5366) p. 1046-8 (1998) ; Oda Anal Chem, 70 (20) , p. 4361-8 (1998) ; y Chen et al. Anal Chem, 77 (2) : p. 658-66 (2005) . Un sistema que requiriese detección externa sería incompatible con funciones de detección en tiempo real, porque tal sistema requeriría la retirada de gran parte de la solución de la reacción de PCR para mediciones externas.

Otro procedimiento de detección usa la detección óptica, que implica intercalar tinciones tales como el SYBR Green (véase Rasmussen et al., Biochemica, 1998 (2) : p. 8-111998) o sondas fluorogénicas como las sondas Taqman (véanse Kalinina, O., et al., Nucleic Acids Res, 25 (10) , p. 1999-2004 (1997) ; Belgrader, P., et al., Science, 284 (5413) , p. 449-50 (1999) ; Belgrader, P., et al. Anal Chem, 75 (14) , p. 3446-50 (2003) ; y Northrup, M.A., et al., Anal Chem, 70 (5) , p. 918-22 (1998) ) . La tinción SYBR Green es una tinción muy específica de asociación al ADN bicatenario para detectar el producto de ADN cuando se acumula durante los ciclos de PCR. Aunque pueden usarse ambos procedimientos de detección en una amplificación de PCR en tiempo real, una distinción entre la tinción intercalante y las técnicas de sonda Taqman es que el procedimiento de detección con tinción intercalante no es específico. Detectará todo el ADN bicatenario, incluyendo los productos no específicos de PCR, tales como formaciones de cavador-dímero. Por esta razón, la amplificación de PCR con una tinción intercalante requiere a menudo un análisis de curva de fusión para distinguir entre un producto deseado de PCR y una amplificación no específica de PCR.

En cambio, el procedimiento de detección de PCR con sonda Taqman es muy específico, porque la generación de la señal fluorescente depende de la hibridación específica entre la sonda y el producto deseado de PCR. Sin embargo, el procedimiento de detección de PCR con sonda Taqman requiere, a diferencia de la tinción SYBR Green, sintetizar sondas individuales para secuencias diferentes, y está restringido por la limitación de las tinciones fluorescentes que pueden usarse para la marcación de sondas (limitadas, por ejemplo, por el número de tinciones de color diferente) y necesita reactivos caros. Un procedimiento de detección alternativo para la PCR es llevar a cabo una separación electroforética de ADN por tamaños de los productos de reacción. Esto permite que el producto deseado de reacción sea identificado por separado de todas las demás fuentes de ADN o de los contaminantes. Muchos sistemas microfluídicos de PCR con detección externa implican el dimensionamiento del ADN, ya sea en gel o mediante electroforesis capilar, porque es específico y no requiere la síntesis de sondas específicas a la diana. En particular, el documento WO 02/081729 da a conocer un sistema microfluídico para la amplificación de ácidos nucleicos en el que se usa la ciclación térmica que comprende un sustrato que tiene una cámara, una pluralidad de canales de flujo que definen un conjunto de cámaras de reacción, y canales de separación para separar y detectar una fracción del ácido nucleico amplificado. El documento US 2007/119711 da a conocer procedimientos y sistemas para ser usados en la separación de materiales de muestra en diferentes fracciones que emplean fluido a presión para la carga simultánea de una muestra y un reactivo en un canal de carga de muestras de un dispositivo microfluídico. El documento US 2007/017812 da a conocer procedimientos y aparatos para proporcionar sistemas mejorados de inyección de muestras y dispositivos microfluídicos con estructuras tales como microcámaras que proporcionan volúmenes de muestras relativamente grandes. Además, el documento WO 05/080606 da a conocer un dispositivo microfluídico de reacción para una PCR cuantitativa en tiempo real en el que se usa la ciclación térmica, y dicho dispositivo consiste en un sustrato que comprende varias cámaras, una pluralidad de canales de flujo (canales de transporte) en comunicación con las cámaras, y una pluralidad de pocillos. El documento WO 05/080606 aborda, además, el problema de la sensibilidad y menciona que el flujo fluídico dentro del dispositivo es un flujo laminar y que la resistencia al flujo en los canales y las cámaras de reacción puede ser calculada usando las fórmulas establecidas en la mecánica de fluidos.

Sumario de la invención Se proporciona un procedimiento de amplificación y detección de ácidos nucleicos para un sistema microfluídico que comprende:

(1) proporcionar un sistema microfluídico que comprende:

un sustrato que tiene una cámara para la amplificación de un volumen de ácido nucleico; una pluralidad de pocillos dispuestos sobre el sustrato; canales de flujo que conectan los pocillos y la cámara en el sustrato para permitir el flujo de la solución

por la cámara; y uno o más canales de separación proporcionados en el sustrato que conectan la cámara y otros pocillos para separar y detectar una fracción del ácido nucleico amplificado en la cámara, estando configurados la cámara, los canales de flujo y los uno más canales de separación de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en las cámaras y los canales de flujo combinados sea al menos 103

veces menor que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación;

(2) disponer una solución de ácido nucleico en la cámara;

(3) amplificar el ácido nucleico dispuesto en la cámara;

(4) introducir desde la cámara una fracción del ácido nucleico amplificado en los uno o más canales de

separación; 15 (5) separar la fracción del ácido nucleico amplificado mediante los uno o más canales de separación; y

(6) detectar el ácido nucleico separado,

en el que las etapas (3) a (6) se repiten una o más veces, o la etapa (3) se repite una o más veces y después las etapas (4) a (6) se ejecutan una vez.

La cámara, los canales de flujo y los uno o más canales de separación del sistema microfluídico están configurados de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en las cámaras y los canales de flujo combinados sea aproximadamente 103 veces menor, o entre aproximadamente 103 y aproximadamente 109 veces menor, o entre aproximadamente 103 y aproximadamente 107 veces menor, o entre aproximadamente 104 y aproximadamente 106 veces menor que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación. La expresión resistencia hidrodinámica al flujo o resistencia hidráulica al flujo denota la resistencia al flujo impulsado por presión y

puede... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de amplificación y detección de ácidos nucleicos para un sistema microfluídico que comprende:

(1) proporcionar un sistema microfluídico que comprende:

un sustrato que tiene una cámara (220) para la amplificación de un volumen de ácido nucleico; una pluralidad de pocillos (240) dispuestos sobre el sustrato; canales (230) de flujo que conectan los pocillos (240) y la cámara (220) en el sustrato para permitir el flujo de la solución por la cámara; y uno o más canales (200) de separación proporcionados en el sustrato que conectan la cámara y otros pocillos para separar y detectar una fracción del ácido nucleico amplificado en la cámara, estando configurados la cámara (220) , los canales (230) de flujo y los uno más canales (200) de separación de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en las cámaras y los canales de flujo combinados sea al menos 103 veces menor que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación;

(2) disponer una solución de ácido nucleico en la cámara (220) ;

(3) amplificar el ácido nucleico dispuesto en la cámara (220) ;

(4) introducir desde la cámara (220) una fracción del ácido nucleico amplificado en los uno o más canales (200) de separación;

(5) separar la fracción del ácido nucleico amplificado mediante los uno o más canales (200) de separación; y 20 (6) detectar el ácido nucleico separado,

en el que las etapas (3) a (6) se repiten una o más veces, o la etapa (3) se repite una o más veces y después las etapas (4) a (6) se ejecutan una vez.

2. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en el sistema microfluídico la proporción entre la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación y la resistencia hidrodinámica al flujo 25 en las cámaras y los canales de flujo está entre aproximadamente 103 y aproximadamente 109.

3. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en el sistema microfluídico un volumen combinado de los uno o más canales de separación es al menos 100 veces menor que un volumen combinado de la cámara y los canales de flujo.

4. El procedimiento según la reivindicación 1 o 3, en el que el sistema microfluídico, además, comprende:

(i) un dispositivo de ciclación térmica para realizar la amplificación de ácido nucleico en la cámara; o (ii) un dispositivo de control de lectura óptica para detectar ópticamente señales de la fracción de ácido nucleico separada electroforéticamente y para procesar la señal.

5. El procedimiento según la reivindicación 4, en el que en el sistema microfluídico la cámara tiene un volumen entre aproximadamente 1 !l y aproximadamente 100 !l, preferentemente entre aproximadamente 10 !l y 35 aproximadamente 25 !l.

6. El procedimiento según la reivindicación 3, en el que en el sistema microfluídico el volumen combinado de los uno o más canales de separación es entre aproximadamente 100 veces y aproximadamente 1000 veces menor que el volumen combinación de la cámara y los canales de flujo.

7. El procedimiento según la reivindicación 1, en el que en el sistema microfluídico la dimensión de los uno o más

canales de separación es menor que la dimensión de cada uno de los canales de flujo y de la cámara, de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación haga el papel de válvula.

8. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que en el sistema microfluídico:

(i) la cámara, los canales de flujo y uno o más canales de separación están configurados de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en las cámaras y los canales de flujo combinados es aproximadamente 45 103 o más veces menor que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación; o (ii) la cámara, los canales de flujo y uno o más canales de separación están configurados de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en las cámaras y los canales de flujo combinados es entre aproximadamente 103 y aproximadamente 109 veces menor que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación; o 50 (iii) la cámara tiene un volumen entre aproximadamente 10 !l y aproximadamente 25 !l.

9. El procedimiento según la reivindicación 7, en el que en el sistema microfluídico:

(i) un volumen de los uno o más canales de separación es al menos 100 veces menor que un volumen combinado de la cámara y los canales de flujo; o

(ii) un volumen de los uno o más canales de separación es entre aproximadamente 100 veces y aproximadamente 1000 veces menor que un volumen combinado de la cámara y los canales de flujo; o

(iii) se proporciona más de un canal de separación en el sustrato para formar una red de canales para un ensayo de dimensionamiento electroforético de ADN.

10. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la amplificación del ácido nucleico dispuesto en la cámara se realiza por ciclación térmica.

11. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9 que, además, comprende:

(7) cuantificar la cantidad de ácido nucleico presente en base a los datos recogidos.

12. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que la cuantificación de la cantidad de ácido nucleico presente se determina calculando un ciclo umbral.

13. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que:

(i) la cámara, los canales de flujo y uno o más canales de separación están configurados de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en las cámaras y los canales de flujo combinados es al menos 103 veces menor que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación; o (ii) la cámara los canales de flujo y uno o más canales de separación están configurados de modo que la resistencia hidrodinámica al flujo en las cámaras y los canales de flujo combinados es entre aproximadamente 103 y aproximadamente 109 veces menor que la resistencia hidrodinámica al flujo en los uno o más canales de separación; o (iii) la cámara tiene un volumen entre aproximadamente 10 !l y aproximadamente 25 !l.

14. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, en el que:

(i) un volumen de los uno o más canales de separación es al menos 100 veces menor que un volumen combinado de la cámara y los canales de flujo; o (ii) un volumen de los uno o más canales de separación es entre aproximadamente 100 veces y aproximadamente 1000 veces menor que un volumen combinado de la cámara y los canales de flujo.

15. El procedimiento según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, en el que se proporciona más de un canal de separación en el sustrato para formar una red de canales para un ensayo de dimensionamiento electroforético de ADN.