Procedimiento de amplificación de ácido nucleico utilizando como molde ácido nucleico bicatenario.

Un procedimiento de amplificacion de acido nucleico a temperatura constante utilizando, como molde, acido nucleico bicatenario, en el que una cadena del acido nucleico bicatenario comprende las regiones F3c, F2c, Fl c, Al, R2 y R3 del lado 3' del acid° nucleico bicatenario y en el que la otra cadena del acido nucleico bicatenario comprende las regiones complementarias F3, F2, Fl, Al c, R2c y R3c del lado 5' del acido nucleico bicatenario, en el que el procedimiento comprende:

a) incubar un molde de acido nucleico bicatenario y un cebador interno RA constituido por las regiones R1c y R2, mediante lo cual la region R2 se hibrida con la region R2c en el molde de acido nucleico bicatenario en presencia de una ADN polimerasa que cataliza una reacción de sintesis de cadena complementaria acompafiada de desplazamiento de cadena, en una condiciOn en la que el acido nucleico bicatenario es inestable utilizando, como origen, el cebador interno RA, tal como una region F2c del acido nucleico molde diana a hibridar por un cebador interno FA constituido por las regiones F1 c y F2, mediante el cual la region F2 se hibrida con la region F2c en el molde de acido nucleico bicatenario que puede amplificar el acid° nucleico molde a una temperatura constante cuando la cadena sencilla liberada se hibrida intramolecularmente consigo misma

b) hibridar un cebador extern

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c) realizar la sintesis de cadena complementaria utilizando, como origen de sintesis, el cebador externo F3, mediante lo cual el producto extendido, sintetizado utilizando como origen el cebador interno FA, se desplaza y se libera como una cadena sencilla; y

d) utilizar la cadena sencilla como molde, el cebador interno RA y el cebador externo R3, mediante lo cual la region R2 se hibrida con la region R2c, y R3 se hibrida con la región R3c en la cadena sencilla desplazada en la etapa c) e iniciar la sintesis de cadena complementaria.

Tipo: Patente Europea. Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: E10008007.

Solicitante: EIKEN KAGAKU KABUSHIKI KAISHA.

Inventor/es: Notomi,Tsugunori, NAGAMINE,KENTARO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE MEDIDA, INVESTIGACION O ANALISIS EN LOS... > Procesos de medida, investigación o análisis en... > C12Q1/68 (en los que intervienen ácidos nucleicos)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Técnicas de mutación o de ingeniería genética;... > C12N15/10 (Procedimientos para el aislamiento, la preparación o la purificación de ADN o ARN (preparación química de ADN o ARN C07H 21/00; preparación de polinucleótidos no estructurales a partir de microorganismos o con la ayuda de enzimas C12P 19/34))

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Fragmento de la descripción:

Procedimiento de amplificación de ácido nucleico utilizando como molde ácido nucleico bicatenario

Campo técnico La presente invención se refiere a un procedimiento de sintetización de un ácido nucleico a temperatura constante que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a un ácido nucleico bicatenario molde, de acuerdo con las reivindicaciones.

Técnica anterior

El procedimiento de la PCR (Reacción en Cadena de la Polimerasa) dependiente de molde para sintetizar ácido nucleico ha sido una gran fuerza impulsora para estudios en el reciente campo de la biociencia. El procedimiento de la PCR permite la amplificación exponencial de un ácido nucleico que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria a un ácido nucleico molde utilizando una pequeña cantidad de molde. El procedimiento de la PCR prevalece ampliamente en la actualidad como una herramienta de clonación o detección de un gen. En el procedimiento de la PCR, para ambos extremos de la secuencia de nucleótidos diana, se utiliza un par de cebadores, que comprende una secuencia de nucleótidos complementaria. El par de cebadores se diseña de tal manera que un cebador se hibrida con un producto de extensión proporcionado por otro cebador. Prosigue una reacción de síntesis repitiendo una hibridación con el producto de extensión mutuo y una reacción de síntesis de cadena complementaria y así se consigue una amplificación exponencial.

En el procedimiento de la PCR, se produce un molde de ácido nucleico monocatenario por algún procedimiento y un cebador se hibrida con el molde. Dado que, como origen de replicación, una ADN polimerasa dependiente de molde requiere un cebador, se considera que la preparación del molde monocatenario es esencial para hibridar el cebador con este en el procedimiento de la PCR. En general, la etapa de convertir un ácido nucleico molde bicatenario en uno monocatenario se denomina desnaturalización. Normalmente la desnaturalización se realiza por calentamiento. Dado que otros componentes de la reacción, necesarios para la síntesis de ácido nucleico, incluyendo la ADN polimerasa, son termorresistentes, las reacciones de desnaturalización y síntesis de cadena complementaria sucesiva puede realizarse combinando todos los componentes de la reacción y calentando a su vez la mezcla de reacción. Sin embargo, los procedimientos convencionales que contienen la etapa de tratamiento térmico tienen los problemas descritos a continuación.

En primer lugar, en el procedimiento de la PCR, la desnaturalización del ácido nucleico bicatenario y la hibridación de un cebador deben realizarse en cada ciclo. Para esta finalidad, se requiere un mecanismo específico para el control de la temperatura. Por ejemplo, aunque se ha desarrollado un procedimiento para controlar el aumento de un producto de reacción durante la PCR, el procedimiento no puede realizarse utilizando un equipo analítico convencional y, por lo tanto, es necesario proporcionar un equipo especializado que tenga un mecanismo para el control de la temperatura para realizar el procedimiento de la PCR, así como un mecanismo para el control de la reacción. Por consiguiente, si todas las reacciones para la síntesis de ácido nucleico pudieran realizarse a temperatura constante, la reacción podría controlarse fácilmente utilizando un equipo analítico convencional. Dicho procedimiento conveniente podría simplificar no solo el equipamiento sino también la operación experimental. Sin embargo, actualmente no se conoce ningún principio de reacción para este procedimiento.

La especificidad de la reacción de la PCR depende de la especificidad de la hibridación del cebador. Puede esperarse que un cebador se hibride con un ácido nucleico monocatenario con una especificidad adecuada a alta temperatura, cerca del punto de fusión. Cuando la temperatura no es adecuadamente alta, a menudo se produce la hibridación no específica y reacciones de síntesis de cadena complementaria no específica resultantes. Dado que el procedimiento de la PCR viene acompañado por un cambio de temperatura complicado, la mezcla de reacción puede estar posiblemente expuesta a una temperatura a la cual puede producirse una reacción no específica. Esta es una de las causas de las reacciones no específicas asociadas con el procedimiento de la PCR.

Se han propuesto diversos procedimientos para resolver el problema de la reacción no específica dependiente de temperatura. Por ejemplo, un procedimiento prácticamente utilizado utiliza un ADN polimerasa que no actúa a una determinada temperatura o inferior. Específicamente, supuestamente se utiliza un inhibidor de ADN polimerasa sensible a temperatura, un anticuerpo contra la ADN polimerasa, o una variante de la ADN polimerasa y similar. Adicionalmente, también se conoce un procedimiento en el que los componentes de la reacción se ponen en compartimentos separados por una división que puede fundirse a alta temperatura, de tal manera que los componentes se mezclan solo después de calentarse a una temperatura adecuada. En todos los caso, dado que el procedimiento de la PCR viene acompañado por un cambio de temperatura complicado, se requiere utilizar un componente especial para prevenir la reacción no específica.

También se conocen (Pro. N. A.S., 89, páginas 392-396; 1992, Nucleic Acid, Res., 20, páginas 1691-1696; 1992) procedimientos de amplificación de ADN que tienen una secuencia complementaria con una secuencia diana utilizando la secuencia diana como un molde, tal como el procedimiento de Amplificación con Desplazamiento de Cadena (SDA, Strand Displacement Amplification) . En el procedimiento SDA, sintetiza una cadena complementaria se sintetiza utilizando, como origen de síntesis un cebador complementario al lado 3' de una secuencia de nucleótidos determinada, una sola ADN polimerasa permite la síntesis de una cadena complementaria que desplaza la región bicatenaria aliado 5'. Cuando en lo sucesivo en el presente documento se refiera "lado 5' " o "lado 3' ", las expresiones significan la dirección de una cadena molde. Este procedimiento se denomina amplificación con desplazamiento de cadena porque la parte bicatenaria del lado 5' se desplaza con una cadena complementaria que se ha sintetizado recientemente.

En el procedimiento SDA, la etapa de cambiar la temperatura, que es esencial para el procedimiento PCR, puede omitirse insertando una secuencia de reconocimiento de enzimas de restricción en una secuencia con la que se hibrida un cebador. Concretamente, un corte enzimático proporcionado por la enzima de restricción da un grupo 3'OH que se convierte en el origen de la síntesis de cadena complementaria. El desplazamiento de cadena y la síntesis de cadena complementaria se realizan desde el origen y la cadena complementaria sintetizada se disocia como una cadena sencilla y se utiliza como molde en la síntesis de cadena complementaria posterior. Por lo tanto, el procedimiento SDA no requiere un control de temperatura complicado que es esencial para el procedimiento de la PCR.

Aunque en el procedimiento SDA no es necesario el control de la temperatura, el tratamiento térmico es aún necesario para preparar la cadena sencilla necesaria para la hibridación del cebador cuando como molde se utiliza ácido nucleico bicatenario. Además, este procedimiento requiere tanto una enzima de restricción, que proporciona un corte enzimático, como una ADN polimerasa con actividad de desplazamiento de cadena. La necesidad de una enzima adicional conduce a un incremento del coste. Además, para introducir un corte enzimático y no escindir la cadena doble (es decir, escindir solo una cadena) , debe utilizarse un derivado de dNTP, tal como a-tio dNTP, como un sustrato para la síntesis de tal manera que una de la cadenas doble es resistente... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un procedimiento de amplificación de ácido nucleico a temperatura constante utilizando, como molde, ácido nucleico bicatenario, en el que una cadena del ácido nucleico bicatenario comprende las regiones F3c, F2c, F1 c, R 1 , R2 Y R3 del lado 3' del ácido nucleico bicatenario y en el que la otra cadena del ácido nucleico bicatenario comprende las regiones complementarias F3, F2, F1, R1c, R2c y R3c del lado 5' del ácido nucleico bicatenario, en el que el procedimiento comprende:

a) incubar un molde de ácido nucleico bicatenario y un cebador interno RA constituido por las regiones R1c y R2, mediante lo cual la reglón R2 se hibrida con la región R2c en el molde de ácido nucleico bicatenario en presencia de una AON pollmerasa que cataliza una reacción de síntesis de cadena complementaria acompañada de desplazamiento de cadena, en una condición en la que el ácido nucleico bicatenario es inestable utilizando, como origen, el cebador interno RA, tal como una región F2c del ácido nucleico molde diana a hibridar por un cebador interno FA constituido por las regiones F1c y F2, mediante el cual la región F2 se hibrida con la región F2c en el molde de ácido nucleico bicatenario que puede amplificar el ácido nucleico molde a una temperatura constante cuando la cadena sencilla liberada se hibrida intramolecularmente consigo misma b) hibridar un cebador externo F3 con la región F3c de la cadena sencilla desplazada en la etapa a) , que se coloca en una condición de tal manera que puede experimentar emparejamiento de bases;

c) realizar la síntesis de cadena complementaria utilizando, como origen de síntesis, el cebador externo F3, mediante lo cual el producto extendido, sintetizado utilizando como origen el cebador interno FA, se desplaza y se libera como una cadena sencilla; y

d) utilizar la cadena sencilla como molde, el cebador interno RA y el cebador externo R3, mediante lo cual la región R2 se hibrida con la región R2c, y R3 se hibrida con la región R3c en la cadena sencilla desplazada en la etapa c) e iniciar la síntesis de cadena complementaria.

2. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, en el que la etapa a) se realiza en presencia de un regulador de temperatura de fusión.

3. El procedimiento de acuerdo con la reivindicación 2, en el que el regulador de temperatura de fusión es al menos uno de los compuestos seleccionados del grupo que consiste en betaína, prolina, dimetil sulfóxido y trimetilamina-Nóxido.

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