PREPARACIÓN DE UNA SUSPENSIÓN DE HUEVOS DE HELMINTOS ALMACENABLE VIABLE.

Preparación de una suspensión de huevos de helmintos almacenable viable La presente invención se refiere a un procedimiento de purificación para la preparación de suspensiones viables, que pueden ser desarrolladas, que contienen huevos de helmintos parasitarios y que son adecuadas para su uso terapéutico. La influencia de las infecciones parasitarias sobre la activación del sistema inmunológico de sus huéspedes animales es conocida (Review, D. M. McKay, Parasitology 2006, 132: 112). La aparición y el desarrollo de enfermedades del sistema inmunológico se ven influenciados también por esta activación. Estudios epidemiológicos muestran que en regiones con altas tasas de infecciones parasitarias son más raras las enfermedades autoinmunes que en regiones en las cuales, debido a mejores condiciones higiénicas, estas tasas de infecciones son menores. Los perfiles de citocinas de pacientes con la enfermedad de Crohn, una enfermedad intestinal inflamatoria crónica, mostraron que los linfocitos inmunes Th2 pueden ser estimuladas por infecciones por helmintos. La enfermedad de Crohn, una enfermedad autoinmune dominada por Th1 puede ser evitada o influida por una infección por helmintos (Summers et al., Am. J. Gastroenterol. 2003, 98: 20342041). También otras enfermedades causadas por linfocitos inmunes Th1, como también la gastritis causada por Helicobacter y la encefalomielitis autoinmunes pueden ser influidas. Ya en 1973 informó Beer (Parasitology 1973, 67: 253262), que el Trichuris suis podría ser un nematodo adecuado para lograr una inmunización en el ser humano, sin que se produzca una infección patógena por nematodos. El Trichuris suis está estrechamente emparentado con Trichuris trichiura y sobrevive en el tracto gastrointestinal humano, pero sin embargo, sin multiplicarse. Durante esta infección autolimitada no son necesarias medidas terapéuticas. Una infección por Trichuris suis puede provocar por lo tanto una inmunización. Hunter et al., Aliment. Pharmacol. Ther. 2004, págs. 167177 describen el uso de helmintos como agentes terapéuticos para enfermedades intestinales inflamatorias. Reddy et al., Parasitol. Res. (2007), págs. 921927 describen el uso de Trichuris suis para el tratamiento de la enfermedad de Crohn. R. J. S. Beer (Parasitology 1972, 65: 343350) describe un método para recolectar y purificar huevos de helmintos. Los huevos de helmintos en el estadio embrionario se cultivan en una solución de dicromato de potasio al 0,2% a 32 °C y se airean diariamente. En el documento DE 101 63 115, se describe un método de purificación similar. Los huevos de helmintos se liberan de microorganismos y virus eventualmente presentes con ayuda de reacciones químicas que producen radicales hidroxilo o de oxígeno. Se describe especialmente la así llamada reacción de Fenton. Durante ésta se genera, bajo la influencia de FeCl2, a partir de H2O2, oxígeno en el estado naciente, cuya acción desinfectante se aprovecha. Boes et al., Veterinary Parasitology (1998), páginas 181190, describen la embrionación y la infecciosidad de huevos del parásito Ascaris suum, que fueron obtenidos de helmintos hembras y se embrionaron en ácido sulfúrico. Summers y colaboradores (GUT 2005, 54: 8790) purifican los huevos de T. suis igualmente con una solución de dicromato al 0,2% en tampón fosfato a pH 67, después que fueron embrionados primero durante 56 semanas en una solución tampón que contenía antibióticos (penicilina/ estreptomicina/anfotericina B). El uso de tales agentes que eliminan las bacterias y virus tiene diversos inconvenientes sustanciales: Tanto con el uso de una solución de dicromato como también con el uso de una solución de Fenton, ésta tiene que ser retirada después de un corto lapso de tiempo, para evitar que se dañen los huevos de helmintos. Ensayos mostraron además que durante la embrionación que se produce después de la purificación (3 meses a 22°C 25°C) a pesar de esta purificación anterior, se produce una fuerte proliferación de gérmenes. Tampoco durante el almacenamiento subsiguiente de los huevos embrionados a 28 °C puede evitarse una proliferación de gérmenes. Por lo tanto es probable que después de retirar los agentes que eliminan a estos microorganismos y virus, se produzca un nuevo crecimiento de gérmenes en la suspensión de huevos de T. suis. Además, es imprescindible una eliminación completa del dicromato de la solución. Esto es, sin embargo, muy costoso. La adición de antibióticos para evitar una fuerte proliferación de gérmenes en el estadio de embrionación de los huevos, como describe Summers, si bien evita un fuerte crecimiento de gérmenes en este estadio, no puede eliminar con seguridad los gérmenes. Después de retirar los antibióticos, en los siguientes pasos de purificación y del almacenamiento hasta el uso, se produce nuevamente un fuerte crecimiento de gérmenes. El documento WO 2007/076868 describe composiciones con huevos de helmintos helmintos que fueron tratados con ácido sulfúrico en el intervalo de pH 0 a 2. Un objetivo de la presente invención es la preparación de una suspensión de huevos de helmintos embrionada, que sea purificada de virus y microorganismos contaminantes, especialmente bacterias, y que pueda ser almacenada sin 2   que se produzca el crecimiento de esporas de hongos y levaduras. Los procedimientos aquí descritos mantienen la capacidad de los huevos de helmintos a desarrollarse a helmintos adultos. Las suspensiones de huevos de helmintos son adecuadas para un uso terapéutico. En el marco de la presente invención se halló sorprendentemente, que para lograr el objeto descrito es especialmente adecuado un procedimiento de purificación y conservación combinado, ya que para este procedimiento, al contrario de los procedimientos conocidos hasta ahora, no se tienen que usar sustancias tóxicas (por ejemplo, dicromato de potasio, K2Cr2O7) y tampoco agentes desinfectantes. Durante el procedimiento de purificación se incuban huevos de helmintos aislados, preferentemente de T. suis, en una solución ácida, preferentemente una solución de H2SO4, con un valor de pH 2 durante un período de 172 h (véase Ejemplo 1). El período de incubación óptimo es de 2 a 8 horas, preferentemente de 3 horas. La incubación se realiza a una temperatura de 4 °C a 37 °C, preferentemente 25 °C a 35 °C. En el procedimiento para la obtención de un preparado farmacéutico de administración oral que contiene una suspensión de huevos viables de helmintos parasitarios, no patógenos para los humanos, que se pueden almacenar, con el cual después de la ingestión se desarrolla una cantidad suficiente de helmintos, lo que lleva a una estimulación de linfocitos T humanos reguladores, se somete primero la suspensión de los huevos de helmintos en un primer paso a un tratamiento ácido a un valor de pH de 2. En otro paso, se eleva el valor del pH a 4 y se añade un conservante farmacológicamente aceptable. Básicamente también es posible añadir primero el conservante y luego realizar el tratamiento ácido. Se prefiere sin embargo realizar primero el tratamiento ácido y luego añadir el conservante. Preferentemente se realiza el tratamiento ácido por adición de ácido sulfúrico. Durante el tratamiento ácido se añade una cantidad suficiente de ácido para bajar el valor del pH a un intervalo entre 0,5 y 2. En otra forma de realización se baja el valor del pH a aprox. 0 hasta <1. Los ácidos adecuados son ácido clorhídrico, ácido nítrico o preferentemente ácido sulfúrico. El tratamiento ácido deber realizarse sólo durante un período de tiempo relativamente corto, para que no se dañen mucho los huevos de los helmintos. Aquí existe también una relación entre concentración de ácido y duración del tratamiento ácido. Preferentemente, el valor de pH se baja a menos de 2, más preferentemente incluso a pH 0,6 hasta 0,8. La duración del tratamiento ácido es de algunos minutos hasta pocas horas, preferentemente 120 minutos hasta 360 minutos. El período de tiempo corto aún tolerable comprende el proceso de embrionación de los huevos de helmintos (3 meses a 22 25 °C). Después del tratamiento ácido, se eleva nuevamente el valor del pH por adición de una base adecuada, por ejemplo NaOH, nuevamente a un valor de pH > 4. A continuación se añaden uno o más conservantes, para lo cual se pueden usar básicamente todas las sustancias adecuadas para la conservación de alimentos o productos farmacéuticos. Preferentemente se usan aquellos conservantes que son bien tolerados justamente por los pacientes que padecen la enfermedad de Crohn. Preferentemente se selecciona el conservante entre el grupo compuesto por ácido sórbico, ácido benzoico, sales de estos ácidos, ésteres del ácido parabenzoico, ésteres del ácido phidroxibenzoico, propilenglicol o combinaciones de estos conservantes. Más preferentemente... [Seguir leyendo]

1. Procedimiento para la preparación de un preparado farmacéutico para administración oral que contiene una suspensión almacenable de huevos viables de helmintos parasitarios, no patógenos para los seres humanos, a saber, de Trichuris suis, con el que, después de la ingestión de la suspensión, se desarrolla un número suficiente de helmintos, lo que produce una estimulación de linfocitos T humanos reguladores, caracterizado porque la suspensión de los huevos de helmintos, en un paso, es sometida a un tratamiento ácido a un valor de pH de 2 y porque, en otro paso, se ajusta el valor del pH a 4 y se añade un conservante farmacológicamente aceptable. 2. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 1, caracterizado porque el tratamiento ácido se realiza por adición de ácido sulfúrico. 3. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque el conservante se selecciona entre el grupo compuesto por ácido sórbico, ácido benzoico, sales de estos ácidos, ésteres del ácido p benzoico, propilenglicol o una combinación de estos conservantes. 4. Procedimiento de acuerdo con la reivindicación 3, caracterizado porque se añaden uno o más de los conservantes seleccionados entre el grupo compuesto por ácido sórbico en una concentración del 0,01 al 0,2% en peso, ácido benzoico en una concentración del 0,1 al 0,3% en peso, ésteres del ácido phidroxibenzoico en una concentración del 0,02 al 0,3% en peso, propilenglicol en una concentración del 5 al 20% en peso, o una combinación de los conservantes mencionados en los intervalos de concentración indicados. 5. Procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones precedentes, caracterizado porque se añaden a la suspensión eventualmente otros aditivos farmacéuticamente aceptables. 6. Preparado farmacéutico de administración oral que contiene una suspensión almacenable de huevos viables de helmintos parasitarios, no patógenos para los seres humanos, a saber Trichuris suis, con el que, después de la ingestión de la suspensión se desarrolla un número suficiente de helmintos, lo que produce una estimulación de linfocitos T reguladores, conteniendo la suspensión menos de 1000 microorganismos formadores de colonias por ml de suspensión, caracterizado porque se prepara de acuerdo con uno de los procedimientos de acuerdo con la reivindicación 1 a 5. 7. Preparado farmacéutico de administración oral de acuerdo con la reivindicación 6, caracterizado porque la suspensión contiene menos de 100 unidades formadoras de colonias de microorganismos por ml de suspensión. 8. Preparado farmacéutico para administración oral de acuerdo con la reivindicación 7, caracterizado porque la suspensión contiene menos de 10 unidades formadoras de colonias de microorganismos por ml de suspensión. 9. Preparado farmacéutico para administración oral de acuerdo con la reivindicación 6 a 8, caracterizado porque los microorganismos son elegidos entre el grupo compuesto por bacterias, virus, hongos, levaduras y protozoos. 10. Uso de una suspensión almacenable de huevos de helmintos parasitarios, a saber, de Trichuris suis, preparada de acuerdo con un procedimiento de acuerdo con una de las reivindicaciones 1 a 5 para la preparación de un preparado farmacéutico para el tratamiento de enfermedades intestinales inflamatorias, especialmente enfermedades intestinales inflamatorias crónicas. 11. Uso de acuerdo con la reivindicación 10, caracterizado porque la enfermedad intestinal inflamatoria es la enfermedad de Crohn. 9