Preparación recombinante de fracciones de bromelaína seleccionadas.

Un método de expresar heterólogamente la proteína de Pro-Bromelaina o un fragmento de la misma,

dichométodo comprendiendo los pasos de:

a) introducir una secuencia de ADN que codifica a la proteína de Pro-bromelaina o el mencionado fragmentode la misma como está contenida en una secuencia como se muestra en las Figuras 6a, 6b, 6c ó 6d y quecarece de la secuencia que codifica el propéptido C-terminal en la Pichia pastoris como un huésped; y

b) expresar dicho constructo en el huésped; en donde el fragmento cubre el sitio activo de la proteína deBromelaina y el propéptido N-terminal; y tiene actividad de proteasa de cisteína.

Preparación recombinante de fracciones de Bromelaina seleccionadas [0001] La presente invención se relaciona en general con la Bromelaina y particularmente con los diferentes compuestos activos contenidos en esta mezcla compleja de proteínas.

La Bromelaina se define bioquímicamente como un extracto en bruto del tallo de la piña y farmacológicamente como una mezcla de proteasas de cisteína. Su multitud de efectos positivos se originan al menos en parte de las propiedades proteolíticas y particularmente fibrinolíticas. También se conocen los efectos anti tumorales de la Bromelaina dependientes de efectos diferentes de la actividad proteolítica y aún de mecanismos desconocidos. La Bromelaina es el nombre colectivo para los enzimas proteolíticos encontrados en tejidos, particularmente del tallo y la fruta, de pantas de la familia de las Bromeliáceas. La forma más común de Bromelaina es una mezcla de varias fracciones derivadas del tallo de la planta de la piña (Ananas comosus) . Se sabe que la Bromelaina del tallo (en lo sucesivo Bromelaina) contiene al menos cinco enzimas proteolíticos y también enzimas no proteolíticos, incluyendo una fosfatasa ácida y una peroxidasa; también puede contener amilasa y actividad de celulosa. Además están presentes otros varios componentes.

Se han descrito varios efectos positivos de la Bromelaina hasta ahora que comprenden propiedades de reducción de edemas, hemolíticas, fibrinolíticas, antiinflamatorias, anti metastásicas e inhibidoras de tumores. Además, también se le han a los efectos beneficiosos del mencionado cóctel de proteasa natural otorgado efectos estimulatorios en el sistema inmune, aceleración de la curación de heridas. Se ha demostrado por Mynott TL y otros (K. Immunol., 163:5 (1999 ( 2568-75) que la Bromelaina bloquea la activación de la ERK-2 en células Th0 estimuladas por la TCR. La Bromelaina también inhibió la IL-2 inducida por PMA, IFN-gamma, y la acumulación de ARNm IL-4, pero no tuvo efecto en la producción de ARNm de citoquina inducida por TCR. Esto sugiere que la mezcla compleja mencionada de proteasas es un inhibidor de la transducción de la señal de las células T.

Debido a la eficacia de la Bromelaina después de la administración oral, su seguridad y falta de efectos secundarios no deseados, la Bromelaina ha ganado aceptación y conformidad crecientes entro los pacientes como un fármaco fitoterapéutico. Se ha reclamado una amplia serie de beneficios terapéuticos para la Bromelaina, como la inhibición reversible de la agregación de plaquetas, angina de pecho, bronquitis, sinusitis, traumas quirúrgicos, tromboflebitis, pielonefritis, y absorción potenciada de fármacos, particularmente de antibióticos (cf. Orsini RA, Plast. Reconstr. Surg., 118 (7) (2206) 1640-4; Brien S, Evid Based Complement Alternat. Med., 1 (3) (2004) 251-7) . Los experimentos bioquímicos indican que estas propiedades farmacológicas dependen de la actividad proteolítica solo en parte, sugiriendo la presencia de factores no proteínicos en la Bromelaina. Los resultados de los estudios preclínicos y farmacológicos recomiendan Bromelaina como un fármaco para la terapia de tumores complementaria. Se supone que la Bromelaina actúa como un inmunomodulador elevando la inmunocitotoxicidad afectada de los monocitos contra las células tumorales de pacientes e induciendo la producción de distintas citoquinas como el factor de necrosis tumoral y las interleucinas (véase. Maurer HR, Cell Mol. Sci., 58 (9) (2001) , 1234-45) . También hay informes en experimentos animales, en los que se describe una eficacia antimetastásica y la inhibición de la agregación de plaquetas asociada con la metástasis así como la inhibición del crecimiento y la invasibilidad de las células tumorales. Aparentemente, la actividad anti-invasiva no depende de la actividad proteolítica. Esto es también verdad para los efectos de la Bromelaina en la modulación de las funciones inmunes, su potencial para eliminar desechos de quemados y para acelerar la curación de heridas.

Un proceso de extracción física para la Bromelaina se divulga por ejemplo en la CN118118. El proceso comprende entre otros pre-tratar la plata de piña con congelación, trituración, y exprimido para obtener zumo, filtrar para obtener líquido claro, concentración con película ultrafiltrante y película de osmosización inversa y secado al vacio por congelación para obtener el producto en la forma de una esponja. Se ha informado que controlar la temperatura, el tiempo y el valor de pH aumenta la actividad de los enzimas y los rendimientos.

La US3658651 se refiere a zumo que contiene Bromelaina extraído de tallos de plantas de piña que es purificado antes de la precipitación de los enzimas pasando el zumo en una relación de intercambio de iones con un intercambiador de aniones en la forma de bicarbonato, un intercambiador de cationes que tiene grupos funcionales ácidos suaves, y un segundo intercambiador de aniones en la forma de bicarbonato.

La US 4.286.064 divulga entre otros la preparación de un extracto bruto de Bromelaina. El zumo del tallo de la piña es primero ajustado a un pH de alrededor de 3 ó 4 con ácido fosfórico, y se añade sulfhidruro de sodio para proteger contra la oxidación del sulfhidrilo. El material inerte es precipitado en por ejemplo acetona y filtrado. El fluido clarificado es precipitado con acetona y el precipitado recogido por centrifugación y o redisuelto en agua que contiene sulfhidruro de sodio que ha sido acidificado con ácido fosfórico y precipitado, o secado en un horno de vacio directamente. Se puede realizar purificación adicional del extracto en bruto por filtración, diálisis o diafiltración para la retirada de moléculas y proteínas pequeñas, seguido por la concentración de la solución obtenida antes de la liofilización.

Carter E. y otros Biochemistr y , 2000, 39, 11005-11013 divulga que la Ananaína puede ser expresada en la E. coli. Las diferentes regiones en la secuencia de aminoácidos de longitud completa, entre otras, están identificados 7 propéptidos C-terminales de aminoácido. Este documento además informa sobre Ananaína activada purificada de la inclusión de cuerpos a pH 4 y 55º C.

La WO 2005/096804 se refiere entre otras cosas a transformar plantas de maíz con constructos de Bromelaina y expresar los mismos en el endoesperma del grano de maíz. en el ejemplo 51 la Bromelaina activa es aislada de la harina hecha del grano transformado. Dicho documento además se refiere a diferentes constructos de Bromelaina subrayados en la SEQ ID NOs: 73-78.

Para evitar la degradación y/o otras reacciones químicas no deseadas, como reacciones de oxidación, es ineluctable la selección de condiciones de tratamiento particulares, como la temperatura, el pH, solventes y reguladores, y/o aditivos, como estabilizantes y antioxidantes.

Aparte de las deficiencias anteriores, puede requerirse una purificación adicional de los extractos en bruto. Dicha purificación puede ser realizada por ejemplo por HPLC como se describe en la US 2002/188107.

Es por lo tanto altamente deseable proporcionar proteínas de Bromelaina químicamente estable así como pura, que pueda ser incluida en composiciones farmacéuticas, dermatológicas y nutricionales y no muestre las deficiencias anteriores de las las formulaciones que contienen Bromelaina del estado de la técnica.

Se puede proporcionar una proteína de Bromelaina expresada heterólogamente o un fragmento de la misma en donde dicha proteína de Bromelaina o fragmento de la misma ha sido expresado en cantidades sustanciales en forma soluble y activa en un huésped heterólogo.

La presente invención se refiere a un método de expresar heterólogamente la proteína de Pro-Bromelaina o un fragmento de la misma, dicho método comprendiendo los pasos de:

a) introducir una secuencia de ADN que codifica la proteína de Pro-Bromelaina o el mencionado fragmento de la misma como está contenida en la secuencia como se muestra en las Figuras 6a, 6b, 6c, ó 6d y carece de la secuencia que codifica el propéptido C-terminal en la Pichia pastoris como un huésped; y b) expresar el mencionado constructo en el huésped, en donde el fragmento cubre el sitio activo de la proteína de Bromelaina y el propéptido N-terminal, y tiene actividad de proteasas de cisteína.

Los presentes inventores han descubierto sorprendentemente que por la expresión heteróloga de las proteínas de Bromelaina individuales o unos fragmentos de las mismas también que se pueden evitar problemas de estabilidad de las proteínas/fragmentos y la composición. Sin desear estar atados a ninguna teoría se asume actualmente que las múltiples proteasas contenidas en la Bromelaina ejercen una actividad... [Seguir leyendo]

1. Un método de expresar heterólogamente la proteína de Pro-Bromelaina o un fragmento de la misma, dicho método comprendiendo los pasos de:

a) introducir una secuencia de ADN que codifica a la proteína de Pro-bromelaina o el mencionado fragmento de la misma como está contenida en una secuencia como se muestra en las Figuras 6a, 6b, 6c ó 6d y que carece de la secuencia que codifica el propéptido C-terminal en la Pichia pastoris como un huésped; y b) expresar dicho constructo en el huésped; en donde el fragmento cubre el sitio activo de la proteína de Bromelaina y el propéptido N-terminal; y tiene actividad de proteasa de cisteína.

2. El método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el huésped es la cepa KM71 o KM71H.

3. El método de acuerdo con la reivindicación 2, en donde se usa pPIC9, pPICZA o pPICZAalpha como vector de expresión.

4. El método de acuerdo con la reivindicación 3, en donde la secuencia de ADN que codifica la proteína de Pro-Bromelaina o el fragmento de la misma ha sido clonada en el vector de expresión usando los sitios de restricción EcoRI y Notl.

5. El método de acuerdo con la reivindicación 4, en donde el vector ha sido linealizado usando un sitio de restricción Bglll.

6. El método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1-5, en donde la proteína de Pro-Bromelaina expresada heterólogamente o el fragmento de la misma lleva adicionalmente medios que permiten la purificación.

7. El método de acuerdo con la reivindicación 6, en donde el mencionado medio que permite la purificación es una secuencia de aminoácidos fusionada con la secuencia que codifica la proteína de Pro-Bromelaina o el fragmento de la misma.

8. El método de acuerdo con la reivindicación 7, en donde el mencionado medio que permite la purificación es una secuencia etiquetada con polihistidina fusionada con el término N-o C- de la secuencia que codifica la proteína de Pro-Bromelaina o el fragmento de la misma.

9. El método de preparar una composición farmacéutica, dermatológica o nutricional que comprende el paso de expresar heterólogamente la Pro-Bromelaina en Pichia pastoris como huésped, dicha Pro-Bromelaina consistiendo del propéptido N-terminal y la proteína de bromelaina como se muestra en cualquiera de las Figuras 5a a 5d o un fragmento de la misma, en donde el fragmento cubre el sitio activo de la proteína de Bromelaina y el propéptido Nterminal, y tiene actividad de proteasa de cisteína, y en donde la proteína de Pro-Bromelaina expresada heterólogamente o el fragmento de la misma no contiene el propéptido C-terminal