Preparación farmacéutica que comprende sobrenadante de cultivo de células mononucleares sanguíneas.

Preparación farmacéutica tópica para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel,

preferiblemente un estado asociado con isquemia, que comprende un sobrenadante de una disoluciónfisiológica que puede obtenerse mediante el cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)o un subconjunto de las mismas en una disolución fisiológica libre de sustancias de proliferación de PBMC yde activación de PBMC durante al menos 1 h.

Preparación farmacéutica que comprende sobrenadante de cultivo de células mononucleares sanguíneas.

La presente invención se refiere a una preparación farmacéutica para tratar estados inflamatorios internos de la piel, preferiblemente estados internos de la piel asociados con isquemia.

La hipoxia, un estado de oxígeno reducido, puede producirse cuando los pulmones se ven comprometidos o se reduce el flujo sanguíneo. La isquemia, reducción en el flujo sanguíneo, puede estar provocada por la obstrucción de una arteria o vena por un coágulo sanguíneo (trombo) o por cualquier materia extraña circulante (émbolo) o por un trastorno vascular tal como aterosclerosis. La reducción en el flujo sanguíneo puede tener una aparición repentina y corta duración (isquemia aguda) o puede tener una aparición lenta con larga duración o recurrencia frecuente (isquemia crónica) . La isquemia aguda se asocia a menudo con necrosis de tejido regional, irreversible (un infarto) , mientras que la isquemia crónica se asocia habitualmente con una lesión de tejido hipóxica transitoria. Sin embargo, si la disminución en la perfusión es prolongada o grave, la isquemia crónica también puede estar asociada con un infarto. Se producen comúnmente infartos en el bazo, riñón, pulmones, cerebro y corazón, produciendo trastornos tales como infarto intestinal, infarto pulmonar, accidente cerebrovascular isquémico e infarto de miocardio.

Los cambios patológicos en trastornos isquémicos dependen de la duración y gravedad de la isquemia, y de la duración de la supervivencia del paciente. Puede observarse necrosis dentro del infarto en las primeras 24 h y se desarrolla una respuesta inflamatoria aguda en el tejido viable adyacente al infarto, migrando leucocitos a la zona de tejido muerto. A lo largo de los días posteriores, existe una degradación gradual y eliminación de células dentro del infarto mediante fagocitosis y sustitución por una cicatriz de colágeno o glial.

La hipoperfusión o el infarto en un órgano afecta a menudo a otros órganos. Por ejemplo, la isquemia del pulmón, provocada, por ejemplo, por una embolia pulmonar, no sólo afecta al pulmón, sino que también pone el corazón y otros órganos, tales como el cerebro, bajo estrés hipóxico. El infarto de miocardio, que implica a menudo bloqueo de la arteria coronaria debido a trombosis, vasospasmos de la pared arterial o infección viral del corazón, puede conducir a insuficiencia cardiaca congestiva e hipotensión sistémica. Pueden desarrollarse complicaciones secundarias tales como encefalopatía isquémica global si el paro cardiaco se prolonga con hipoperfusión continuada. La isquemia cerebral, provocada de la manera más común por oclusión vascular debida a aterosclerosis, puede variar en gravedad de ataques isquémicos transitorios (TIA) a infarto cerebral o accidente cerebrovascular. Aunque los síntomas de los TIA son temporales y reversibles, los TIA tienden a repetirse y a menudo van seguidos por un accidente cerebrovascular.

La enfermedad arterial oclusiva incluye enfermedad de la arteria coronaria, que puede conducir a infarto de miocardio, y enfermedad arterial periférica, que puede afectar a la aorta abdominal, sus ramificaciones principales y arterias de las piernas. La enfermedad arterial periférica incluye enfermedad de Buerger, enfermedad de Raynaud y acrocianosis. Aunque la enfermedad arterial periférica está provocada comúnmente por aterosclerosis, otras causas principales incluyen, por ejemplo, diabetes, etc. Las complicaciones asociadas con la enfermedad arterial periférica incluyen calambres graves en las piernas, angina, ritmos cardiacos anómalos, insuficiencia cardiaca, ataque al corazón, accidente cerebrovascular e insuficiencia renal.

Los trastornos isquémicos e hipóxicos son una causa principal de morbimortalidad. Las enfermedades cardiovasculares son responsables del 30% de los fallecimientos en todo el mundo. Entre las diversas enfermedades cardiovasculares, la cardiopatía isquémica y las enfermedades cerebrovasculares provocan aproximadamente el 17% de los fallecimientos.

Actualmente, el tratamiento de trastornos isquémicos e hipóxicos se centra en el alivio de los síntomas y el tratamiento de trastornos causales. Por ejemplo, los tratamientos para el infarto de miocardio incluyen nitroglicerina y analgésicos para controlar el dolor y aliviar la carga de trabajo del corazón. Se usan otros medicamentos, incluyendo digoxina, diuréticos, amrinona, betabloqueantes, agentes hipolipemiantes e inhibidores de la enzima convertidora de angiotensina, para estabilizar el estado, pero ninguna de estas terapias se ocupa directamente del daño al tejido producido por la isquemia y la hipoxia.

Debido a las deficiencias en los tratamientos actuales, sigue habiendo una necesidad de métodos que sean eficaces en el tratamiento de estados que implican hipoxia. También existe la necesidad de métodos que sean eficaces en la prevención de daño al tejido provocado por isquemia que se produce debido a, por ejemplo, aterosclerosis, diabetes y trastornos pulmonares.

Los estados asociados con isquemia e hipoxia van acompañados habitualmente de inflamación. Por tanto, se necesitan medios y métodos que también reduzcan la inflamación.

Es un objeto de la presente invención proporcionar medios que permitan el tratamiento eficaz de estados inflamatorios, preferiblemente estados asociados con isquemia.

La presente invención se refiere a una preparación farmacéutica tópica para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel, preferiblemente un estado de la piel asociado con isquemia, que comprende un sobrenadante de una disolución fisiológica que puede obtenerse mediante el cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o un subconjunto de las mismas en una disolución fisiológica libre de sustancias de proliferación de PBMC y de activación de PBMC durante al menos 1 h.

Resultó que la administración de una preparación farmacéutica tal como se definió anteriormente a un paciente que presentaba un estado inflamatorio de la piel, preferiblemente un estado de la piel asociado con isquemia, da como resultado un alivio de los síntomas respectivos y un proceso de curación.

La preparación farmacéutica de la presente invención comprende el sobrenadante de PBMC cultivadas o un subconjunto de las mismas. En el transcurso del cultivo de PBMC, estas células expresan y secretan sustancias como citocinas que difieren de las expresadas y secretadas en PBMC activadas. Esto significa que el secretoma de las PBMC de la presente invención es diferente del secretoma de PBMC activadas. Las células de la presente invención experimentan una producción de secretoma desencadenada por un resto de superficie no celular. Por tanto, es sorprendente que el sobrenadante de las PBMC que no se han puesto en contacto con sustancias de activación de PBMC como PHA o LPS pueda emplearse para tratar estados inflamatorios de la piel, lo que muestra que el secretoma de estas células comprende sustancias que soportan el tratamiento de dichos estados. El sobrenadante es particularmente adecuado para tratar un estado isquémico de la piel.

El sobrenadante de PBMC según la presente invención puede obtenerse mediante el cultivo de las mismas en una disolución fisiológica que no comprende sustancias de proliferación de PBMC y de activación de PBMC. Sin embargo, las PBMC se incuban en la disolución fisiológica durante al menos 1 h. Se requiere este tiempo de cultivo mínimo para dejar que las PBMC secreten citocinas y otras sustancias beneficiosas.

Las PBMC que forman parte de la preparación según la presente invención pueden obtenerse de sangre completa usando métodos conocidos en la técnica tales como gradiente de Ficoll, lisis hipotónica, etc. Estos métodos se conocen ampliamente en la técnica.

Las PBMC de la preparación farmacéutica pueden obtenerse de una reserva de donantes o del mismo individuo al que se le administrará la preparación.

La disolución fisiológica de la que se obtiene el sobrenadante comprende al menos 500, preferiblemente al menos 1000, más preferiblemente al menos 105, incluso más preferiblemente al menos 106, células por ml de disolución o por unidad de dosificación.

“Disolución fisiológica”, tal como se usa en el presente documento, se refiere a una disolución líquida en la que las PBMC se cultivan antes de su uso en la preparación farmacéutica según la presente invención.

“Disolución fisiológica” se refiere también a una disolución que no conduce a la muerte de las PBMC en el plazo de una hora, preferiblemente en el plazo de 30 min. Si el número de PBMC viables... [Seguir leyendo]

1. Preparación farmacéutica tópica para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel, preferiblemente un estado asociado con isquemia, que comprende un sobrenadante de una disolución fisiológica que puede obtenerse mediante el cultivo de células mononucleares de sangre periférica (PBMC)

o un subconjunto de las mismas en una disolución fisiológica libre de sustancias de proliferación de PBMC y de activación de PBMC durante al menos 1 h.

2. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según la reivindicación 1, caracterizada porque dicho estado se selecciona del grupo que consiste en heridas, isquemia tisular, heridas crónicas, heridas de diabéticos, úlcera de la piel, quemaduras de la piel, colgajos de piel en cirugía plástica y regeneración de tejido tras injertos dentales.

3. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según la reivindicación 1 ó 2, caracterizada porque el subconjunto de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) es de células T, células B o células NK.

4. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 3, caracterizada porque la disolución fisiológica es una disolución de sal fisiológica, preferiblemente una disolución de NaCl fisiológica, sangre completa, una fracción sanguínea, preferiblemente suero o un medio de cultivo celular.

5. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según la reivindicación 4, caracterizada porque el medio de cultivo celular se selecciona del grupo que consiste en RPMI, DMEM, X-vivo y Ultraculture.

6. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 5, caracterizada porque las células se cultivan en condiciones de inducción de estrés.

7. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según la reivindicación 6, caracterizada porque las condiciones de inducción de estrés incluyen hipoxia, ozono, calor, radiación, productos químicos, presión osmótica, desplazamiento de pH o combinaciones de los mismos.

8. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 7, caracterizada porque las PBMC o un subconjunto de las mismas se someten a estrés durante el cultivo con al menos 10 Gy, preferiblemente al menos 20 Gy, más preferiblemente al menos 40 Gy, con ozono, con temperatura elevada o con radiación UV.

9. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 8, estando dicha preparación caracterizada porque se proporciona como un gel, preferiblemente hidrogel, como una pomada, como un parche dérmico, como una matriz farmacéuticamente aceptable, preferiblemente en una matriz de colágeno/elastina, como una pasta, como una crema, como un polvo, como un linimento o como una loción.

10. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 9, caracterizada porque el sobrenadante se liofiliza.

11. Preparación para su uso en el tratamiento de un estado inflamatorio de la piel según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 10, caracterizada porque las PBMC o un subconjunto de las mismas se cultivan en dicha disolución durante al menos 4 h, preferiblemente durante al menos 6 h, más preferiblemente durante al menos 12 h.

12. Uso de una preparación según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, para la fabricación de un medicamento para tratar un estado inflamatorio de la piel, preferiblemente un estado asociado con isquemia.

13. Método para preparar una preparación farmacéutica tópica según una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 11, que comprende las etapas de

a) proporcionar células mononucleares de sangre periférica (PBMC) o un subconjunto de las mismas,

b) cultivar las células de la etapa a) en una disolución fisiológica libre de sustancias de proliferación de PBMC y de activación de PBMC durante al menos 1 h,

c) aislar el sobrenadante de la etapa b) , y

d) preparar la preparación farmacéutica usando el sobrenadante de la etapa c) .

14. Método según la reivindicación 13, caracterizado porque las células se someten a condiciones de inducción de estrés antes de o en el transcurso de la etapa b) , en el que dichas condiciones de inducción de estrés incluyen hipoxia, ozono, calor, radiación, productos químicos, presión osmótica, desplazamiento de pH o combinaciones de los mismos.

15. Método según la reivindicación 13 ó 14, caracterizado porque las células se irradian antes de o en el transcurso de la etapa b) con al menos 10 Gy, preferiblemente al menos 20 Gy, más preferiblemente al menos 40 Gy, con ozono, con temperatura elevada o con radiación UV.

16. Preparación farmacéutica que puede obtenerse mediante un método según una cualquiera de las reivindicaciones 13 ó 15.