Predicción y diagnóstico de la mielopatía degenerativa canina.

Un método de identificación de si un perro tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar mielopatía degenerativa,

o de tener crías que tengan o se encuentren en riesgo de desarrollar mielopatía degenerativa, que comprende:

(a) proporcionar una muestra que contenga ácido nucleico de dicho perro;

(b) evaluar la estructura de un gen SOD1 o la transcripción correspondiente al resto de aminoácido 40 del correspondiente polipéptido SOD1 en dicha muestra que contiene ácido nucleico de dicho perro; y

(c) identificar si dicho perro (i) tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar miolopatía degenerativa cuando se observa un polimorfismo en la región de codificación de SOD1 correspondiente a una sustitución homocigótica de E®K en el resto de aminoácido 40 del correspondiente polipéptido SOD1, en comparación con una transcripción o un gen SOD1 de tipo silvestre de referencia; o (iii) produce descendencia que tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar miolopatía degenerativa cuando se observa un polimorfismo en la región de codificación de SOD1 correspondiente a una sustitución heterocigótica de E®K en el resto de aminoácido 40 del correspondiente polipéptido SOD1, en comparación con una transcripción o un gen SOD1 de tipo silvestre de referencia.

Predicción y diagnóstico de la mielopatía degenerativa canina 1. Campo de la invención La presente invención se refiere, en general, a los campos de la genética molecular, la medicina veterinaria, la neurología veterinaria, la neurología humana y la medicina humana. Más concretamente, se refiere a la enfermedad veterinaria mielopatía degenerativa canina y la enfermedad humana esclerosis lateral amiotrófica. En concreto, la invención se refiere al uso de marcadores genéticos para identificar la presencia de un factor de riesgo genético principal para la mielopatía degenerativa canina, que es una enfermedad veterinaria fatal, y un modelo para la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) .

2. Descripción de la técnica relacionada La mielopatía degenerativa canina (MDC; también conocida como radiculomielopatía degenerativa crónica) es una enfermedad neurológica común en los pastores alemanes, corgis galés y varias otras razas. La enfermedad es crónica y progresiva, y puede producir la cojera del animal y, con el tiempo, puede conducir a una amplia parálisis de las patas traseras. El animal podría quedar lisiado en unos cuantos meses o puede que sobreviva hasta 3 años. En cualquier escenario, la enfermedad debilita al animal, dificulta gravemente la calidad de vida, culmina en la eutanasia y es devastadora para los dueños de las mascotas y criadores por igual.

La MDC es una afección crónica incurable, aunque puede ser posible mantener la calidad de vida del perro durante un breve período tiempo mediante un programa adecuado de ejercicio y nutrición. Se recomienda el ejercicio para mantener la capacidad del perro para caminar, y la fisioterapia puede prolongar el período de tiempo en que el perro sigue teniendo movilidad y aumentar el tiempo de supervivencia, pero el resultado final no es favorable. Todavía no hay tratamientos de eficacia probada para detener o retardar la progresión de la MDC. Aunque no está aprobado por la Administración de Alimentos y Fármacos (AAF) , el ácido aminocaproico (AEAC) y la n-acetilcisteína (NAC) pueden retardar la progresión, pero este tratamiento todavía es experimental y polémico.

De acuerdo con Green et al, 2002, “The American Genetic Association” 93:119-124, se han encontrado mutaciones en el gen humano SOD1 en la esclerosis lateral amiotrófica (ELA) .

Considerando la naturaleza debilitante de la enfermedad y la falta de tratamientos de eficacia probada, la identificación de marcadores genéticos para permitir la identificación de los animales que tienen predisposición a desarrollar MDC sería muy beneficiosa para los criadores y dueños de mascotas por igual.

Sumario de la invención Así pues, de acuerdo con la presente invención, se proporciona un método de identificación de si un perro tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar mielopatía degenerativa, o de tener crías que tengan o se encuentren en riesgo de desarrollar mielopatía degenerativa, que comprende (a) proporcionar una muestra que contenga ácido nucleico de dicho perro; y (b) evaluar la estructura de un gen SOD1 o la transcripción correspondiente al resto de aminoácido 40 del correspondiente polipéptido SOD1 en dicha muestra que contiene ácido nucleico de dicho perro; y (c) identificar si dicho perro (i) tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar miolopatía degenerativa cuando se observa un polimorfismo en la región de codificación de SOD1 correspondiente a una sustitución homocigótica de E→K en el resto de aminoácido 40 del correspondiente polipéptido SOD1, en comparación con una transcripción o un gen SOD1 de tipo silvestre de referencia; o (iii) tiene crías que tienen o se encuentran en riesgo de desarrollar miolopatía degenerativa cuando se observa un polimorfismo en la región de codificación de SOD1 correspondiente a una sustitución heterocigótica de E→K en el resto de aminoácido 40 del correspondiente polipéptido SOD1, en comparación con una transcripción o un gen SOD1 de tipo silvestre de referencia. El perro puede ser un bóxer, un corgi galés, un retriever de Chesapeake, un Ridgeback de Rodesia, un pastor alemán, un Kerr y Blue Terrier, un setter irlandés, un antiguo pastor inglés, un collie, un caniche estándar, un Fox terrier de pelo duro, otra raza, o un híbrido de los mismos. La etapa (b) puede comprender la pirosecuenciación, la hibridación de sonda competitiva, la secuenciación de terminación de cadena, la digestión de restricción, la reacción de la polimerasa específica de alelo, el análisis del polimorfismo en la configuración de una sola cadena, el análisis genético, el ensayo de discriminación alélica TaqMan®, la electroforesis en gel de gradiente de temperatura, la reacción en cadena de la ligasa, los perfiles de la curva de fusión o la hibridación de micromatrices, el análisis de micromatrices en combinación con otros ensayos de marcadores de ácido nucleico, o puede comprender la evaluación de la estructura de un locus genético que está en desequilibrio de unión con dicho marcador genético.

La secuencia del exón 2 de SOD1 de tipo silvestre de referencia puede comprender la siguiente secuencia:

La presente solicitud también describe un método de evaluación de un tratamiento para la mielopatía degenerativa canina o la esclerosis lateral amiotrófica que comprende evaluar la eficacia de una posible terapia contra dicha mielopatía degenerativa o esclerosis lateral amiotrófica en un perro que tiene una mutación en un gen SOD1 en comparación con una transcripción o un gen SOD1 de tipo silvestre de referencia; en el que el perro ha recibido la posible terapia. El perro puede ser un bóxer, un corgi galés, un retriever de Chesapeake, un Ridgeback de Rodesia, un pastor alemán, un Kerr y Blue Terrier, un setter irlandés, un antiguo pastor inglés, un collie, un caniche estándar, un Fox terrier de pelo duro, otra raza, o un híbrido de los mismos. La mutación puede ser un polimorfismo en la región de codificación de SOD1 correspondiente a una sustitución de E→K en el resto 40 del polipéptido SOD1. La evaluación puede comprender la exploración neurológica, pruebas de electrodiagnóstico, TC/mielografía, resonancia magnética o formación de imágenes funcionales, o la evaluación puede comprender la inmunohistopatología de médula espinal.

Se contempla que cualquier método o composición descritos en el presente documento se puede implantar con respecto a cualquier otro método o composición descritos en el presente documento.

El uso de la palabra "un", “uno” o "una", cuando se usa junto con el término "que comprende" en las reivindicaciones y/o en la memoria descriptiva, puede significar "uno", pero también coincide con el significado de "uno o más", "al menos uno" y "uno o más de uno".

Estas y otras realizaciones de la invención se apreciarán y entenderán mejor si se consideran en combinación con la siguiente descripción y las figuras adjuntas. Sin embargo, se ha de entender que la siguiente descripción, aunque indica diversas realizaciones de la invención y numerosos datos específicos de la misma, se da a modo de ilustrativo y no limitante.

Breve descripción de las figuras Las siguientes figuras forman parte de la presente memoria descriptiva, y se incluyen para demostrar adicionalmente ciertos aspectos de la presente invención. La invención se puede comprender mejor por referencia a una o más de dichas figuras en combinación con la descripción detallada de las realizaciones específicas presentadas en el presente documento.

Fig. 1A-C – Cartografía de un locus de MD principal. (Fig. 1A) El GWA de 49, 663 SNP usando 38 casos (astringencias fenotípicas 1 a 4) y 17 controles de corgi galés de Pembroke identificó un locus principal en CFA31 (pgenoma = 0, 18) y señales más débiles en otros cromosomas usando 10.000 permutaciones en PLINK (38) . (Fig. 1B) La región CFA31 de la asociación abarca ∼1, 5 Mb e incluye SOD1. Se muestran los valores de P de la cartografía fina con 90 SNP en 63 casos (niveles de astringencias fenotípicas 1-3) y 144 controles de 5 razas (Bóxer, 8/15 [caso/control]; retriever de Chesapeake, 9/48; perro pastor alemán, 4/54; corgi galés de Pembroke, 35/17; y ridgeback de Rodesia, 7/8) , así como la asociación de la mutación sin sentido, que fue analizada por separado. (Fig. 1C) . Los datos de cartografía fina muestran que un haplotipo de 195 kb que rodea la mutación de SOD1 está asociado en las 5 razas y que este haplotipo es más antiguo que la mutación de SOD1. Fig. 2A-B -Histopatología de médula espinal. (Fig. 2A) Tinción con azul rápido de luxol y ácido per y ódico de Schiff de una sección transversal de médula espinal torácica de un corgi galés de Pembroke de... [Seguir leyendo]

1. Un método de identificación de si un perro tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar mielopatía degenerativa,

o de tener crías que tengan o se encuentren en riesgo de desarrollar mielopatía degenerativa, que comprende: 5

(a) proporcionar una muestra que contenga ácido nucleico de dicho perro;

(b) evaluar la estructura de un gen SOD1 o la transcripción correspondiente al resto de aminoácido 40 del correspondiente polipéptido SOD1 en dicha muestra que contiene ácido nucleico de dicho perro; y

(c) identificar si dicho perro (i) tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar miolopatía degenerativa cuando se

observa un polimorfismo en la región de codificación de SOD1 correspondiente a una sustitución homocigótica de E→K en el resto de aminoácido 40 del correspondiente polipéptido SOD1, en comparación con una transcripción o un gen SOD1 de tipo silvestre de referencia; o (iii) produce descendencia que tiene o se encuentra en riesgo de desarrollar miolopatía degenerativa cuando se observa un polimorfismo en la región de codificación de SOD1 correspondiente a una sustitución heterocigótica de E→K en el resto de aminoácido 40 del

correspondiente polipéptido SOD1, en comparación con una transcripción o un gen SOD1 de tipo silvestre de referencia.

2. El método de la reivindicación 1, en el que dicho perro es un bóxer, un corgi galés, un retriever de Chesapeake,

un Ridgeback de Rodesia, un pastor alemán, un Kerr y Blue Terrier, un setter irlandés, un antiguo pastor inglés, un 20 collie, un caniche estándar, un Fox terrier de pelo duro otra raza, o un híbrido de los mismos.

3. El método de la reivindicación 1, en el que la etapa (b) comprende pirosecuenciación, secuenciación de terminación de cadena, digestión de restricción, reacción de la polimerasa específica de alelo, análisis del polimorfismo en la configuración de una sola cadena, análisis genéticos, electroforesis en gel de gradiente de temperatura, reacción en cadena de la ligasa, perfiles de la curva de fusión, ensayo de discriminación alélica TaqMan® o hibridación de micromatrices.

4. El método de la reivindicación 1, en el que la muestra que contiene ácido nucleico comprende sangre, tejido bucal, piel, semen o folículos pilosos de dicho perro. 30

5. El método de la reivindicación 1, en el que dicho gen SOD1 de tipo silvestre de referencia comprende SEC ID Nº

1.