Predicción de reacciones alérgicas.

Un método in vitro para identificar compuestos químicos que son sensibilizadores o no sensibilizadores y/o alérgenos o no alérgenos, el método comprende

(i) preparar una muestra de sangre de donantes para aislar una población de células T y una población de células dendríticas derivadas de monocitos de ahí;

(ii) incubar las células dendríticas derivadas de monocitos con un compuesto de prueba entre 2 a 24 horas;

(iii) incubar las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el compuesto con la población de células T aisladas en la etapa (i) entre 3 a 7 días por medio del uso de las mismas condiciones de cultivo como para la etapa (ii) excepto que si el suero de ternera fetal se usa en la etapa (ii), se reemplaza con suero autólogo inactivado por calor;

(iv) incubar las células T y las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el compuesto de (iii) con una muestra de biopsia de piel obtenida a partir del mismo donante entre 1 a 3 días; y

(v) evaluar la hipersensibilidad y las reacciones alérgicas por cambios histológicos clasificados en la muestra de biopsia de piel en comparación con un control, en donde los cambios histológicos son ya sea vacuolización de las células epidérmicas, o daños a los queratinocitos basales o la conexión entre la epidermis y la dermis;

en donde se usan condiciones de cultivo de células que permitan el crecimiento y mantenimiento de las células.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/GB2011/052312.

Solicitante: Alcyomics Ltd.

Nacionalidad solicitante: Reino Unido.

Dirección: Bulman House, Regent Centre, Gosforth Newcastle upon Tyne, Tyne and Wear NE33LS REINO UNIDO.

Inventor/es: DICKINSON,ANNE.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION G — FISICA > METROLOGIA; ENSAYOS > INVESTIGACION O ANALISIS DE MATERIALES POR DETERMINACION... > Investigación o análisis de materiales por métodos... > G01N33/50 (Análisis químico de material biológico, p. ej. de sangre, de orina; Investigación o análisis por métodos en los que interviene la formación de uniones bioespecíficas con grupos coordinadores; Investigación o análisis inmunológico (procedimientos de medida, de investigación o análisis diferentes de los procedimientos inmunológicos en los que intervienen enzimas o microorganismos, composiciones o papeles reactivos a este efecto; procedimientos para preparar estas composiciones, procedimientos de control sensibles a las condiciones del medio en los procedimientos microbiológicos o enzimáticos C12Q))

PDF original: ES-2455598_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Predicción de reacciones alérgicas.

Esta presente invención se refiere a un método para predecir la inmunogenicidad y la hipersensibilidad o reacciones alérgicas a compuestos terapéuticos potenciales, cosméticos y sensibilizadores químicos. El método proporciona un ensayo in vitro que emplea células derivadas de sangre y piel cultivada y es de particular utilidad en la identificación y predicción de sensibilizadores de la piel y particularmente de agentes que pueden provocar dermatitis de contacto alérgica. Aunque no de conformidad con la invención como se reivindica, el ensayo de la presente invención proporciona entre otros métodos de tamizaje de genotecas de compuestos para la actividad de sensibilización y por lo tanto los kits.

ANTECEDENTES

La reacción de hipersensibilidad de tipo retardado de la dermatitis de contacto alérgica (ACD) se puede adquirir cuando un individuo sensibilizado, más tarde, se desafía con la misma molécula pequeña. La ACD se manifiesta durante la fase de provocación; después de la penetración de la epidermis y de la captación/procesamiento por una célula presentadora de antígeno (APC) - una célula especializada dentro de la piel, que presenta el alérgeno o antígeno a otras células conocidas como células T reclutadas por las quimocinas a la piel, que provocan su activación y la producción de altos niveles de linfoquinas. Estas moléculas dan lugar a una respuesta secundaria con inflamación de la piel y la apoptosis de los queratinocitos (célula de la piel) . A diferencia de su pariente más cercano, la dermatitis de contacto irritativa (ICD) , cuya causa son los irritantes (por ejemplo, jabón, detergentes, perfumes, etc) y que puede afectar a alguien que sucumbe a suficiente exposición, la ACD está influenciada por factores ambientales y genéticos y puede tardar muchos años en manifestarse, mucho después del contacto inicial. Con aproximadamente 20% de la población adulta en general que se cree que es alérgica a uno o más sensibilizadores químicos, y con una creciente lista de nuevos productos cosméticos y farmacéuticos que están disponibles, la ACD amenaza con ser un futuro problema de salud laboral y de consumo cada vez mayor. El desarrollo de métodos adecuados y sensibles para la evaluación del potencial de un producto químico para causar ACD será una etapa crucial en la lucha contra esta enfermedad. Con respecto a las alergias a los fármacos, estas rara vez se detectan en estudios no clínicos y generalmente sólo se observan en ensayos clínicos Fase 3 o durante la comercialización, cuando poblaciones más grandes están expuestas al fármaco. Aunque el número de fármacos que provocan reacciones alérgicas es relativamente bajo, el impacto potencial es muy alto debido a la etapa de desarrollo tardía en que se detecta. Por lo tanto, es necesario que los métodos no clínicos para predecir el potencial para producir reacciones alérgicas ayuden en la selección de los compuestos.

La identificación de los productos químicos que tienen el potencial de inducir reacciones de hipersensibilidad cutánea es un componente obligatorio de los nuevos descubrimientos de productos por las industrias farmacéuticas y de cosméticos. Históricamente, las pruebas de predicción se han basado exclusivamente en pruebas in vivo en animales. En la prueba tradicional en conejillo de indias, el producto se pinta sobre el cuerpo y el conejillo de indias después se inyecta con un producto químico adicional para ayudar a acentuar el efecto del producto químico de prueba en el desarrollo de la dermatitis. Como alternativa en la prueba de hinchazón de la oreja de ratón, las orejas del ratón se pintan con la sustancia de prueba y su respuesta inmunológica se determina por el examen del tejido de los ganglios linfáticos. Sin embargo, con una impresionante prohibición de la UE sobre las pruebas con animales que se acerca a su plena aplicación, hay una necesidad urgente para el desarrollo de alternativas de técnicas predicativas in vitro e in silico. Aunque se conoce a partir de la técnica anterior la calibración ascendente y/o regulación descendente de los productos de genes tales como citocinas estos ensayos son laboriosos y los resultados son inconsistentes. Actualmente existe el modelo in vitro no validado para predecir la inmunogenicidad y la hipersensibilidad o reacciones alérgicas a compuestos terapéuticos potenciales, cosméticos y sensibilizadores químicos.

En este contexto, el documento de la técnica anterior F.H.M. PISTOOR y otros: "Novel predictive assay for contact allergens using human skin explant cultures", AMERICAN JOURNAL OF PATHOLOGY (publicado por la AMERICAN SOCIETY FOR INVESTIGATIVE PATHOLOGY) vol. 149, núm. 1, 1 enero 1996, páginas 337-343, ISSN: 0002-9440 describe un ensayo de explante de piel para identificar alérgenos y sensibilizadores, en el que las biopsias de piel se incubaron con compuestos de prueba y se observaron los cambios histológicos asociados las células dendríticas en dicha biopsia.

Hay por lo tanto una necesidad de un ensayo in vitro para discriminar entre sensibilizadores y no sensibilizadores para la predicción de la naturaleza de sensibilización de nuevos productos farmacéuticos, cosméticos y químicos. Existe una necesidad de un ensayo robusto, precisa y sencillo para los nuevos compuestos de prueba para la hipersensibilidad y reacciones alérgicas.

BREVE RESUMEN DE LA DESCRIPCIÓN

De acuerdo con un primer aspecto de la invención se proporciona un método in vitro para identificar compuestos químicos que son sensibilizadores o no sensibilizadores y/o alérgenos o no alérgenos, el método comprende

(i) preparar una muestra de sangre de donantes para aislar una población de células T y una población de células dendríticas derivadas de monocitos de ahí;

(ii) incubar las células dendríticas derivadas de monocitos con un compuesto de prueba;

(iii) incubar las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el compuesto con la población de células T aisladas en la etapa (i) ;

(iv) incubar las células T y las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el compuesto de (iii) con una muestra de biopsia de piel obtenida a partir del mismo donante; y

(v) evaluar la hipersensibilidad y las reacciones alérgicas por cambios histológicos clasificados en la muestra de biopsia de piel tratada de (iv) en comparación con un control.

Preferentemente, la población de células T está comprendida en una población de células mononucleares de sangre periférica, de tal modo que el método comprende:

(i) preparar una muestra de sangre del donante para aislar una población de células mononucleares de sangre periférica que comprende una población de células T y una población de células dendríticas derivadas de monocitos de ahí;

(ii) incubar las células dendríticas derivadas de monocitos con un compuesto de prueba;

(iii) incubar las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el compuesto con la población de células mononucleares de sangre periférica que comprende una población de células T aisladas en la etapa (i) ;

(iv) incubar las células mononucleares de sangre periférica que comprende la población de células T y las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el compuesto de (iii) con una muestra de biopsia de piel obtenida a partir del mismo donante; y

(v) evaluar la hipersensibilidad y reacciones alérgicas por cambios histológicos clasificados en la muestra de biopsia de piel tratada de (iv) en comparación con un control.

Preferentemente, la evaluación de hipersensibilidad y reacciones alérgicas por cambios histológicos clasificados en la muestra... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Un método in vitro para identificar compuestos químicos que son sensibilizadores o no sensibilizadores y/o alérgenos o no alérgenos, el método comprende

(i) preparar una muestra de sangre de donantes para aislar una población de células T y una población de células dendríticas derivadas de monocitos de ahí;

(ii) incubar las células dendríticas derivadas de monocitos con un compuesto de prueba entre 2 a 24 horas;

(iii) incubar las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el compuesto con la población de células T aisladas en la etapa (i) entre 3 a 7 días por medio del uso de las mismas condiciones de cultivo como para la etapa (ii) excepto que si el suero de ternera fetal se usa en la etapa (ii) , se reemplaza con suero autólogo inactivado por calor;

(iv) incubar las células T y las células dendríticas derivadas de monocitos tratadas con el compuesto de (iii) con una muestra de biopsia de piel obtenida a partir del mismo donante entre 1 a 3 días; y

(v) evaluar la hipersensibilidad y las reacciones alérgicas por cambios histológicos clasificados en la muestra de biopsia de piel en comparación con un control, en donde los cambios histológicos son ya sea vacuolización de las células epidérmicas, o daños a los queratinocitos basales o la conexión entre la epidermis y la dermis;

en donde se usan condiciones de cultivo de células que permitan el crecimiento y mantenimiento de las células.

2. Un método de acuerdo con la reivindicación 1 en donde el donante es un donante humano.

3. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 en donde las células T y las células dendríticas derivadas de monocitos (DCs) se aíslan a partir de células mononucleares de sangre periférica (PBMC) .

4. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células dendríticas se generan a partir de monocitos CD14+ a partir de PBMCs y el resto de la población de PBMC agotada de monocitos se usa como la preparación de "células T " de la etapa (iii) .

5. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde las células dendríticas son ya sea células dendríticas estándar o maduradas rápido.

6. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde la biopsia de piel es una biopsia de raspado o de ponche que comprende una tira o cuadrado de piel de aproximadamente 4 mm de área.

7. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores que incluyen adicionalmente el análisis de la expresión de las células T y/o las células dendríticas derivadas de monocitos.

8. Un método de acuerdo con cualquiera de las reivindicaciones anteriores en donde el control se selecciona a partir del grupo que comprende:

(i) una muestra adicional o segunda que se ha sometido al método de la reivindicación 1, excepto que las células dendríticas derivadas de monocitos se ha incubado en la etapa (ii) con un compuesto que es un nosensibilizador conocido en lugar de un compuesto de prueba;

(ii) una muestra adicional o segunda que se ha sometido al método de la reivindicación 1, excepto que las células dendríticas derivadas de monocitos se han incubado en la etapa (ii) sin compuestos químicos adicionales en lugar de un compuesto de prueba;

(iii) una muestra adicional o segunda que se ha sometido al método de la reivindicación 1, excepto que las células dendríticas derivadas de monocitos se han incubado en la etapa (ii) sin compuestos químicos adicionales en lugar de un compuesto de prueba y las células dendríticas derivadas de monocitos de la etapa

(iii) se incuban con células T alogénicas.

9. Un método de acuerdo con la reivindicación 1, en donde el método es para determinar la potencia del compuesto, en donde la etapa (v) evalúa la potencia por cambios histológicos clasificados en la muestra de biopsia de piel tratada de (iv) en comparación con un control, en donde los cambios histológico son ya sea vacuolización de las células epidérmicas, o daños en los queratinocitos basales o la conexión entre la epidermis y la dermis.

10. Un ensayo in vitro para evaluar la hipersensibilidad y las reacciones alérgicas que comprende células dendríticas derivadas de monocitos y células T autólogas y una biopsia de piel derivada a partir del donante autólogo, en donde la hipersensibilidad y las reacciones alérgicas se evalúan por cambios histológicos clasificados en la muestra de biopsia de piel, en donde los cambios histológicos son o vacuolización de las células epidérmicas, o daños en los queratinocitos basales o la conexión entre la epidermis y la dermis.

11. Un método in vitro para identificar anticuerpos que son sensibilizadores o no-sensibilizadores y/o alérgenos o no alérgenos, el método comprende

(i) incubar una población de células mononucleares de sangre periférica aisladas a partir de una muestra de sangre del donante con un anticuerpo de prueba;

(ii) incubar las células mononucleares de sangre periférica tratadas con el anticuerpo de (i) con una muestra de biopsia de piel obtenida a partir del mismo donante; y

(iii) evaluar la hipersensibilidad y las reacciones alérgicas por cambios histológicos clasificados en la muestra de biopsia de piel tratada de (ii) en comparación con un control, en donde los cambios histológicos son ya sea vacuolización de las células epidérmicas, o daños a los queratinocitos basales o la conexión entre la epidermis y la dermis.

12. El método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el donante es un donante humano.

13. Un método de acuerdo con la reivindicación 11 o la reivindicación 12, en donde la biopsia de piel es una biopsia de raspado que comprende una tira o cuadrado de piel de aproximadamente 4 mm de área.

14. Un método de acuerdo con la reivindicación 11, en donde el método es para determinar la potencia de un anticuerpo, en donde la etapa (iii) evalúa la potencia por cambios histológicos clasificados en la muestra de biopsia de piel tratada de (ii) en comparación con un control, en donde los cambios histológicos son ya sea vacuolización de las células epidérmicas, o daños en los queratinocitos basales o la conexión entre la epidermis y la dermis.

15. Uso de un método de acuerdo con una cualquiera de las reivindicaciones 1 a 14 para determinar el modo de acción de sensibilización de un compuesto de prueba.