Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico con chaperona de enfermedades.

Una chaperona farmacológica específica para α-Gal A para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabry en un paciente que expresa una forma mutante de α

-Gal A y que se ha determinado que responde al tratamiento con una chaperona farmacológica específica, donde se determina que el paciente responde al tratamiento con la chaperona farmacológica específica para α-Gal A mediante un método que comprende

a. sembrar unas primeras y segundas células huésped en un recipiente de ensayo;

b. poner en contacto las primeras células huésped con la chaperona farmacológica específica para α-Gal A; y

c. comparar la actividad de α-Gal A en las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica, con la actividad de α-Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica específica,

donde

la chaperona farmacológica específica para α-Gal A es 1-desoxigalactonojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de esta;

las primeras y segundas células huésped son células HEK-293 MSR que expresan la forma mutante de α-Gal A del paciente; y donde:

un incremento de 1.3 a 40 veces más en la actividad de α-Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica en comparación con la actividad de α-Gal A expresada por las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica; o

una actividad de α-Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica de al menos aproximadamente un 2-100% de la actividad de α-Gal A de células HEK-293 MSR que expresan una forma natural de α-Gal A;

indica que el paciente responderá al tratamiento con la chaperona farmacológica específica.

Método para predecir la respuesta al tratamiento farmacológico con chaperona de enfermedades Campo de la invención La presente invención proporciona métodos para determinar si un paciente con la enfermedad de Fabr y se beneficiaría del tratamiento con una chaperona farmacológica específica. La presente descripción también 5 proporciona un método in vitro para determinar la capacidad de respuesta enzimática (p. ej., -galactosidasa A, -glucosidasa o glucocerebrosidasa) a una chaperona farmacológica (p. ej., 1-desoxigalactonojirimicina, 1-deoxinojirimicina o isofagomina) en una línea celular que expresa una forma mutante de la enzima. La descripción también proporciona un método para diagnosticar un trastorno por acumulación lisosomal (p. ej., enfermedad de Fabr y , enfermedad de Pompe o enfermedad de Gaucher) en pacientes que se sospecha que padecen un trastorno 10 por acumulación lisosomal y para implementar el tratamiento adecuado en función del diagnóstico (p. ej., elegir un agente terapéutico particular que administrar al paciente) .

Antecedentes

En el cuerpo humano, las proteínas están involucradas en casi todos los aspectos de la función celular. Las 15 proteínas son cadenas lineales de aminoácidos que se pliegan y enroscan en formas tridimensionales específicas para funcionar correctamente. Determinadas enfermedades humanas son el resultado de mutaciones que provocan cambios en la secuencia de aminoácidos de una proteína, los cuales reducen su estabilidad y pueden impedir que se pliegue de manera apropiada. La mayoría de las mutaciones genéticas que conducen a la producción de proteínas menos estables o con un plegamiento erróneo se denominan mutaciones en sentido erróneo. Estas 20 mutaciones provocan la sustitución de un aminoácido simple por otro en la proteína. Debido a este error, las mutaciones en sentido erróneo generalmente dan como resultado proteínas que tienen un nivel reducido de actividad biológica. Aparte de las mutaciones en sentido erróneo, también hay otros tipos de mutaciones que pueden dar lugar a proteínas con actividad biológica reducida.

Las proteínas generalmente se pliegan en una región específica de la célula conocida como el retículo endoplásmico 25 o RE. La célula tiene mecanismos de control de calidad que aseguran que las proteínas se plieguen en la forma tridimensional correcta antes de que puedan partir del RE hacia el destino apropiado en la célula, proceso al que generalmente se hace referencia como tráfico de proteínas. Las proteínas con plegamiento erróneo generalmente se eliminan por los mecanismos de control de calidad luego de ser inicialmente retenidas en el RE. En determinadas instancias, las proteínas con plegamiento erróneo pueden acumularse en el RE antes de ser eliminadas. 30

La retención de proteínas con plegamiento erróneo en el RE interrumpe su tráfico apropiado y la actividad biológica reducida resultante puede conducir a una función celular deficiente y finalmente a una enfermedad. Además, la acumulación de proteínas con plegamiento erróneo en el RE puede conducir a diversos tipos de tensión en las células, lo cual también puede contribuir a la disfunción celular y la enfermedad.

Las enfermedades por acumulación lisosomal (LSD, por sus siglas en inglés) se caracterizan por deficiencias de las 35 enzimas lisosomales debido a mutaciones en los genes que codifican las enzimas lisosomales. Esto produce la acumulación patológica de los sustratos de dichas enzimas, que incluyen lípidos, carbohidratos y polisacáridos. Existen aproximadamente cincuenta LSD conocidas a la fecha, las cuales incluyen la enfermedad de Gaucher, la enfermedad de Fabr y , la enfermedad de Pompe, la enfermedad de Tay Sachs y las mucopolisacaridosis (MPS) . La mayoría de las LSD se heredan como un rasgo autosómico recesivo, aunque los varones con la enfermedad de 40 Fabr y y MPS II son hemicigotos ya que los genes de la enfermedad se codifican en el cromosoma X. Para la mayoría de las LSD, no se dispone de ningún tratamiento aparte del tratamiento sintomático. Para varias LSD, incluidas Gaucher, Fabr y , Pompe y MPS I y VI, se dispone de la terapia de reemplazo enzimático (TRE) que utiliza enzimas recombinantes. Para la enfermedad de Gaucher, también se dispone de la terapia de reducción de sustrato (TRS) en situaciones limitadas. La TRS emplea una pequeña molécula inhibidora de una enzima requerida para la 45 síntesis de glucosilceramida (el sustrato GD) . El objetivo de la TRS es reducir la producción del sustrato y reducir la acumulación patológica.

Si bien hay muchos genotipos mutantes diferentes asociados con cada LSD, algunas de las mutaciones, incluidas algunas de las mutaciones más prevalentes, son mutaciones en sentido erróneo que pueden conducir a la producción de una enzima menos estable. Estas enzimas menos estables a veces se degradan prematuramente por 50 el sistema de degradación asociado al RE. Esto produce la deficiencia de la enzima en el lisosoma y la acumulación patológica de sustrato. A veces, en la técnica correspondiente, se hace referencia a dichas enzimas mutantes como "mutantes de plegamiento" o "mutantes conformacionales".

Diagnóstico de la enfermedad de Fabr y 55

Debido a que la enfermedad de Fabr y es poco común, implica múltiples órganos, tiene una franja de aparición etaria amplia y es heterogénea, un diagnóstico adecuado supone un reto. Es poco conocida entre los profesionales sanitarios y los diagnósticos erróneos son frecuentes. Algunos ejemplos de diagnósticos seriamente considerados en pacientes a los que finalmente se les diagnosticó la enfermedad de Fabr y incluyen: prolapso de la válvula mitral, glomerulonefritis, proteinuria idiopática, lupus eritematoso sistémico, enfermedad de Whipple, abdomen agudo, colitis ulcerativa, porfiria aguda intermitente y neoplasia maligna oculta. Así pues, incluso para los varones 5 tradicionalmente afectados, el diagnóstico requiere aproximadamente 5-7 años o incluso más. Esto resulta preocupante, ya que cuanto más tiempo padezca una persona la enfermedad de Fabr y , más probable será que se produzca un daño mayor en los órganos y tejidos afectados, y que el estado de la persona empeore. El diagnóstico de la enfermedad de Fabr y se suele confirmar sobre la base de una disminución de la actividad de -Gal A en leucocitos plasmáticos o periféricos (LEU) , una vez que un paciente es sintomático, acompañada de un análisis 10 mutacional. En mujeres, el diagnóstico supone un reto aún mayor ya que la identificación enzimática de mujeres portadoras es menos fiable debido a la inactivación aleatoria del cromosoma X en algunas células de las portadoras. Por ejemplo, algunas portadoras obligadas (hijas de varones tradicionalmente afectados) tienen actividades enzimáticas de -Gal A que varían de actividades normales a muy bajas. Debido a que las portadoras pueden tener una actividad enzimática de -Gal A normal en leucocitos, únicamente la identificación de una mutación en -Gal A 15 mediante pruebas genéticas proporciona una identificación de portadoras y/o un diagnóstico preciso.

Tratamiento de la enfermedad de Fabr y Una terapia autorizada para tratar la enfermedad de Fabr y es la terapia de reemplazo enzimático, que suele implicar la infusión intravenosa de una forma purificada de la proteína natural correspondiente (Fabrazyme®, Genzyme 20 Corp.) . Una de las principales complicaciones con la terapia de reemplazo proteínico es la obtención y el mantenimiento de cantidades terapéuticamente eficaces de proteína in vivo debido a la rápida degradación de la proteína infundida. La estrategia actual para superar este problema es llevar a cabo numerosas y costosas infusiones de dosis altas.

La terapia de reemplazo proteico presenta varios riesgos adicionales, como dificultades para la generación a gran 25 escala, purificación y acumulación de una proteína debidamente plegada; obtención de una proteína glucosilada natural; generación de una respuesta inmunitaria anti-proteína; e incapacidad de la proteína para atravesar la barrera hematoencefálica para mitigar las patologías del sistema nervioso central (es decir, baja biodisponibilidad) . Además, la enzima de reemplazo no puede penetrar en el corazón o el riñón en cantidades suficientes para reducir la acumulación de sustrato en los podocitos renales o miocitos cardiacos, que aparecen predominantemente en la 30 patología de Fabr y .

También se está perfeccionando la terapia génica con vectores recombinantes, que contienen secuencias de ácidos nucleicos que codifican una proteína funcional, o con células humanas modificadas genéticamente, que expresan una proteína funcional, para tratar deficiencias proteínicas y otros trastornos... [Seguir leyendo]

1. Una chaperona farmacológica específica para -Gal A para su uso en el tratamiento de la enfermedad de Fabr y en un paciente que expresa una forma mutante de -Gal A y que se ha determinado que responde al 5 tratamiento con una chaperona farmacológica específica, donde se determina que el paciente responde al tratamiento con la chaperona farmacológica específica para -Gal A mediante un método que comprende a. sembrar unas primeras y segundas células huésped en un recipiente de ensayo;

b. poner en contacto las primeras células huésped con la chaperona farmacológica específica para -Gal A; y

c. comparar la actividad de -Gal A en las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona 10 farmacológica específica, con la actividad de -Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica específica, donde

la chaperona farmacológica específica para -Gal A es 1-desoxigalactonojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de esta; 15

las primeras y segundas células huésped son células HEK-293 MSR que expresan la forma mutante de -Gal A del paciente; y donde:

un incremento de 1.3 a 40 veces más en la actividad de -Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica en comparación con la actividad de -Gal A expresada por las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica; o 20

una actividad de -Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica de al menos aproximadamente un 2-100% de la actividad de -Gal A de células HEK-293 MSR que expresan una forma natural de -Gal A;

indica que el paciente responderá al tratamiento con la chaperona farmacológica específica.

2. Un método para determinar si un paciente que expresa una forma mutante de -Gal A responderá al tratamiento con una chaperona farmacológica específica para -Gal A, comprendiendo el método:

a. sembrar unas primeras y segundas células huésped en un recipiente de ensayo;

b. poner en contacto las primeras células huésped con la chaperona farmacológica específica para -Gal A; y 30

c. comparar la actividad de -Gal A en las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica, con la actividad de -Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica específica,

donde 35

la chaperona farmacológica específica para -Gal A es 1-desoxigalactonojirimicina o una sal farmacéuticamente aceptable de esta;

las primeras y segundas células huésped son células HEK-293 MSR que expresan la forma mutante de -Gal A del 40 paciente; y donde:

un incremento de 1.3 a 40 veces más en la actividad de -Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica en comparación con la actividad de -Gal A expresada por las segundas células huésped que no están en contacto con la chaperona farmacológica específica; o 45

una actividad de -Gal A en las primeras células huésped que están en contacto con la chaperona farmacológica específica de al menos aproximadamente un 2-100% de la actividad de -Gal A de células HEK-293 MSR que expresan una forma natural de -Gal A;

indica que el paciente responderá al tratamiento con la chaperona farmacológica específica.

3. Una chaperona farmacológica específica para el uso según se reivindica en la reivindicación 1 o un método según se reivindica en la reivindicación 2, donde la forma mutante de -Gal A se debe a una mutación en sentido erróneo en un gen que codifica -Gal A.

4. Una chaperona farmacológica específica para el uso o un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1 - 3, donde se identifica que el paciente expresa una -galactosidasa A es una -galactosidasa A mutante seleccionada del grupo conformado por las mutaciones de -galactosidasa A: A121T, A156V, A20P, A288D, A288P, A292P A348P, A73V, C52R, C94Y, D234E, D244H, D244N, D264Y, E338K, E341D, E358K, E398K, 5 E48K, E59K, E66Q, F113L, G144V, G183D, G260A, G271S, G325D, G328A, G35R, G373D, G373S, H225R, I219N, I242N, I270T, I289F, I303N, I317T, I354K, I91T, L14P, L166V, L243F, L300F, L310F, L32P, L45R, M267I, M284T, M296I, M296V, M72V, M76R, N224S, N263S, N298K, N298S, N320I, N320Y, N34K, P205R, P259L, P265L, P265R, P293A, P293S, P409S, P40L, P40S, Q279E, Q279H, Q279R, Q280H, Q280K, Q312H, Q321E, Q321R, Q327E, R301P, R342Q, R363C, R363H, R49G, R49L, R49S, S201Y, S276N, S297C, S345P, T194I, V269M, V316E, 10 W340R, W47L y W95S.

5. Una chaperona farmacológica específica para el uso o un método según se reivindica en la reivindicación 4, donde la -galactosidasa A mutante se selecciona del grupo conformado por las mutaciones de -galactosidasa A: G144V, H225R, S276G, R301P y N320I. 15

6. Una chaperona farmacológica específica para el uso o un método según se reivindica en la reivindicación 5, donde la chaperona farmacológica específica es clorhidrato de 1-desoxigalactonojirimicina.

7. Una chaperona farmacológica específica para su uso o un método según se reivindica en la reivindicación 6 o la 20 reivindicación 7, donde la primera célula huésped se pone en contacto con 1-desoxigalactonojirimicina en una concentración de 20 nM a 1 mM.

8. Una chaperona farmacológica específica para su uso o un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-7, donde la actividad de la proteína se determina utilizando un ensayo fluorimétrico que cuantifica 25 la hidrólisis de sustrato en lisados de la célula huésped.

9. Una chaperona farmacológica específica para su uso o un método según se reivindica en cualquiera de las reivindicaciones 1-8, donde el paciente es una mujer.

10. Un método para producir una tabla de terapia de tratamiento, donde la tabla de terapia de tratamiento indica si una chaperona farmacológica específica es un compuesto eficaz para incrementar la actividad de una -Gal A mutante, donde el método comprende llevar a cabo un método según se reivindica en la reivindicación 2; y registrar el resultado de dicho método en la tabla de terapia de tratamiento, donde una chaperona farmacológica específica registrada en la tabla de terapia de tratamiento que provoca: 35

un incremento de 1.3 a 40 veces más en la actividad de -Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica específica en comparación con la actividad de -Gal A expresada por la segunda célula huésped que no está en contacto con la chaperona farmacológica específica; o una actividad de -Gal A en la primera célula huésped que está en contacto con la chaperona farmacológica 40 específica de al menos aproximadamente un 2-100% de la actividad de -Gal A de una célula huésped que expresa una forma natural de la proteína;

es una chaperona farmacológica específica que se puede utilizar como terapia para un paciente que expresa la proteína mutante.