Polipéptidos y polinucleótidos de Porphyromonas gingivalis.

Un polipéptido antigénico de Porphyromonas gingivalis aislado que puede provocar una respuesta inmunitariacontra P.

gingivalis, polipéptido que comprende:

una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383; o

una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % o al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO. 526 o la SEQ IDNO. 383; o

al menos 40 aminoácidos que tengan una secuencia contigua de al menos 40 aminoácidos idéntica a una secuenciacontigua de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383.

Polipéptidos y polinucleótidos de Porphyromonas gingivalis

Campo de la invención La presente invención se refiere a secuencias de nucleótidos de P. gingivalis, polipéptidos de P. gingivalis y sondas para la detección de P. gingivalis. Los polipéptidos y nucleótidos de P. gingivalis se pueden usar en composiciones para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria contra P. gingivalis en un sujeto y tratar o evitar o reducir la gravedad de la afección conocida como periodontitis.

Antecedentes de la invención Las enfermedades periodontales son enfermedades inflamatorias asociadas con bacterias de los tejidos de soporte de los dientes y varían desde la forma de gingivitis relativamente leve, la inflamación inespecífica reversible del tejido gingival hasta las formas de periodontitis más agresivas que se caracterizan por la destrucción de las estructuras de soporte del diente. La periodontitis se asocia con una infección subgingival de un grupo de bacterias gramnegativas específicas que conduce a la destrucción del periodonto y es un gran problema de salud pública. Una bacteria que ha atraído un interés considerable es P. gingivalis, dado que la recuperación de este microorganismo de lesiones de periodontitis en adultos puede ser hasta el 50 % de la flora subgingival cultivable anaeróbicamente, mientras que rara vez se recupera P. gingivalis, y cuando se hace es en pocas cantidades, de sitios sanos. Se ha asociado un aumento proporcional en el nivel de P. gingivalis en la placa subgingival con un aumento de la gravedad de la periodontitis y la erradicación del microorganismo de la población microbiana subgingival cultivable va acompañada de la resolución de la enfermedad. Se ha demostrado la progresión de las lesiones por periodontitis en primates no humanos con la implantación subgingival de P. gingivalis. Estos descubrimientos tanto en animales como en seres humanos apuntan a una función principal de P. gingivalis en el desarrollo de la periodontitis en adultos.

P. gingivalis es un bacilo gramnegativo proteolítico, asacarolítico, anaerobio, de pigmentación negra que obtiene energía del metabolismo de aminoácidos específicos. El microorganismo requiere indispensablemente para su proliferación hierro, preferentemente en forma de hemo o su producto de oxidación de Fe (III) hemina, y cuando prolifera en condiciones de exceso de hemina es altamente virulento en animales de experimentación. Se han implicado una serie de factores de virulencia en la patogenicidad de P. gingivalis, incluidos la cápsula, adhesinas, citotoxinas y enzimas hidrolíticas extracelulares.

Con el fin de desarrollar una vacuna segura y eficaz para evitar, eliminar o reducir la colonización por P. gingivalis es necesario identificar y producir antígenos que estén implicados en la virulencia que tengan utilidad como inmunógenos posiblemente a través de la generación de anticuerpos específicos. Aunque es posible intentar aislar los antígenos directamente de cultivos de P. gingivalis, con frecuencia es difícil. Por ejemplo como se menciona anteriormente, P. gingivalis es un anaerobio estricto y puede ser difícil de aislar y cultivar. También se sabe que, para una serie de organismos, cuando se cultivan in vitro, muchos genes de virulencia se regulan por disminución y las proteínas codificadas dejan de expresarse. Si se aplican técnicas de química convencionales para purificar candidatos de vacuna, puede que no se identifiquen moléculas (protectoras) potencialmente importantes. Con la secuenciación de ADN, como el gen está presente (pero no transcrito) aun cuando el organismo se cultiva in vitro, se puede identificar, clonar y producir como una proteína de ADN recombinante. De forma similar, el organismo in vitro 45 puede expresar de forma transitoria un antígeno protector u objetivo terapéutico o se pueden producir en bajos niveles que hacen la identificación de estas moléculas extremadamente difícil por métodos convencionales.

Con la identificación serológica de los objetivos terapéuticos se limitan las respuestas a las que son detectables utilizando métodos comunes tales como transferencia de bandas western o ELISA. La limitación en este caso es tanto el nivel de respuesta que genera el animal o ser humano como determinar si esta respuesta es protectora, dañina o irrelevante. Con un enfoque de secuenciación para la identificación de posibles objetivos profilácticos o terapéuticos no existen limitaciones de este tipo.

También es bien conocido que P. gingivalis produce una variedad de proteasas ampliamente activas (solicitud de 55 patente internacional N. º WO97/16542 de la Universidad de Melbourne, patentes de Estados Unidos N os 5.475.097 y 5.523.390) , lo que dificulta la identificación de proteínas intactas debido a su degradación por estas proteasas.

Sumario de la invención Los presentes inventores han intentado aislar secuencias de nucleótidos de P. gingivalis que se pueden usar para la producción recombinante de polipéptidos de P. gingivalis y para desarrollar sondas nucleotídicas específicas para P. gingivalis. Las secuencias de ADN que se enumeran más adelante se han seleccionado de entre una gran cantidad de secuencias de P. gingivalis de acuerdo con su potencial indicador como candidatos de vacuna. Esta etapa intuitiva implicó la comparación de la secuencia proteínica deducida de las secuencias de ADN de P. gingivalis con 65 las bases de datos de secuencias proteínicas conocidas. Algunas de las características usadas para seleccionar candidatos de vacuna útiles incluyen: la ubicación celular esperada, tal como proteínas de membrana externa o proteínas secretadas, actividades funcionales particulares de proteínas similares tales como aquellas con una actividad enzimática o proteolítica, proteínas implicadas en rutas metabólicas esenciales que, cuando se inactivan o bloquean, pueden ser perjudiciales o letales para el organismo, proteínas que se podría esperar que desempeñen una función en la patogenia del microorganismo, p. ej., lisis de glóbulos rojos, aglutinación celular, o receptores celulares y proteínas que son parálogas a proteínas con eficacia de vacuna demostrada.

En un primer aspecto la presente invención proporciona un polipéptido antigénico de Porphyromonas gingivalis aislado, polipéptido que comprende;

una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383; o una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % o al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO. 526 o la SEQ ID NO. 383; o al menos 40 aminoácidos que tengan una secuencia contigua de al menos 40 aminoácidos idéntica a una secuencia contigua de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383.

Tal como se usa en el presente documento, el % de identidad para polipéptidos se ha de calcular usando el algoritmo de alineación de Needleman y Munsch (9) usando una matriz de puntuación de proteínas estándar 20 (Blosum 50) .

En un segundo aspecto, la presente invención consiste en un polipéptido antigénico de Porphyromonas gingivalis aislado, comprendiendo el polipéptido una secuencia de aminoácidos seleccionada del grupo que consiste en SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383, descritas en la tabla 3.

En un tercer aspecto, la presente invención consiste en una molécula de ADN aislada, molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto de la presente invención.

La molécula de ADN puede comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 119 o SEQ ID NO. 262.

En un cuarto aspecto, la presente invención consiste en un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN del tercer aspecto de la presente invención enlazado de forma funcional a un elemento regulador de la transcripción.

La presente invención también proporciona una célula aislada que comprende este vector de expresión recombinante.

En un aspecto adicional, la presente invención consiste en un método para producir una polipéptido de P. gingivalis que comprende cultivar la célula en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

En un aspecto adicional más, la presente invención proporciona una composición para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria dirigida contra P. gingivalis en un sujeto, composición que comprende una cantidad eficaz de al menos un polipéptido del primer aspecto de la presente invención, o al menos una molécula de ADN del tercer aspecto de la presente invención, o ambos, y un vehículo farmacéuticamente aceptable. Se prefiere que el vehículo 45 farmacéuticamente aceptable sea un adyuvante. En otro aspecto, la presente invención proporciona una composición de este tipo para su uso en el tratamiento de la infección... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido antigénico de Porphyromonas gingivalis aislado que puede provocar una respuesta inmunitaria contra P. gingivalis, polipéptido que comprende:

una secuencia de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383; o

una secuencia de aminoácidos al menos un 85 % o al menos un 95 % idéntica a la SEQ ID NO. 526 o la SEQ ID NO. 383; o al menos 40 aminoácidos que tengan una secuencia contigua de al menos 40 aminoácidos idéntica a una secuencia contigua de aminoácidos de SEQ ID NO. 526 o SEQ ID NO. 383.

2. Una molécula de ADN aislada, molécula de ADN que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el 15 polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1.

3. Una molécula de ADN aislada como se reivindica en la reivindicación 2 que comprende una secuencia de nucleótidos de SEQ ID NO. 119 o SEQ ID NO. 262.

4. Un vector de expresión recombinante que comprende la molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 2 o 3, enlazada de forma funcional a un elemento regulador de la transcripción.

5. Una célula aislada que comprende el vector de expresión recombinante como se reivindica en la reivindicación 4.

6. Un método para producir un polipéptido de P. gingivalis que comprende cultivar la célula como se reivindica en la reivindicación 5 en condiciones que permitan la expresión del polipéptido.

7. Una composición para su uso en la obtención de una respuesta inmunitaria dirigida contra P. gingivalis en un sujeto, composición que comprende un vehículo farmacéuticamente aceptable y una cantidad eficaz de al menos un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1 y/o al menos una molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 3 o la reivindicación 4.

8. Una composición como se reivindica en la reivindicación 7 para su uso en el tratamiento de infecciones por P.

gingivalis. 35

9. Una composición como se reivindica en la reivindicación 8, en la que el tratamiento es un tratamiento profiláctico.

10. Un anticuerpo obtenido contra un polipéptido como se reivindica en la reivindicación 1.

11. Una composición que comprende al menos un anticuerpo como se reivindica en la reivindicación 10.

12. Un método para detectar la presencia de una molécula de ADN como se reivindica en la reivindicación 2 o la reivindicación 3 en una muestra, que comprende:

poner en contacto una muestra con una sonda nucleotídica que comprende al menos 18 nucleótidos y que tiene una secuencia contigua de al menos 18 nucleótidos idéntica a una secuencia contigua de nucleótidos de SEQ ID NO. 37 en condiciones en las que se pueda formar un híbrido entre la sonda y la molécula de ADN como se define en la reivindicación 2 o la reivindicación 3 en la muestra; y

detectar el híbrido formado en la etapa (a) , en el que la detección de un híbrido indica la presencia de una molécula de ADN como se define en la reivindicación 2 o la reivindicación 3 en la muestra.

13. Un método como se reivindica en la reivindicación 12, en el que la sonda comprende además una marca detectable.