Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos.

Polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID nº: 2, de SEC ID nº: 4 o de SEC ID nº: 6;

(b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 100% de identidad con el dominio catalítico mostrado como los aminoácidos 22 a 476 de SEC ID nº: 2, de SEC ID nº: 4 o de SEC ID nº: 6;

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 90%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 100% de identidad con la secuencia codificante de SEC ID nº: 1, de SEC ID nº: 3 o de SEC ID nº: 5 que codifica los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID nº: 2, de SEC ID nº: 4 o de SEC ID nº: 6.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/US2010/058438.

Solicitante: NOVOZYMES A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: KROGSHOEJVEJ 36 2880 BAGSVAERD DINAMARCA.

Inventor/es: LANDVIK,Sara, MORANT,MARC DOMINIQUE, AYABE,KEIICHI, COWARD-KELLY,GUILLERMO.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos orgánicos que contienen... > C12P7/06 (Etanol como producto químico y no como bebida alcohólica)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > PROCESOS DE FERMENTACION O PROCESOS QUE UTILIZAN... > Preparación de compuestos que contienen radicales... > C12P19/14 (preparados por acción de una carbohidrasa, p. ej. por acción de la alfa-amilasa)
  • SECCION C — QUIMICA; METALURGIA > BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE;... > MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS... > Enzimas, p. ej. ligasas (6.; Proenzimas; Composiciones... > C12N9/34 (Glucoamilasa)

PDF original: ES-2534098_T3.pdf

 

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Fragmento de la descripción:

Polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los mismos Referencia a un listado de secuencias

[1] Esta solicitud contiene un listado de secuencias en formato legible por ordenador.

Referencia a un depósito de material biológico

[2] Esta solicitud contiene una referencia a un depósito de material biológico. Para información completa véase el último párrafo de la descripción.

Antecedentes de la invención

Campo de la invención

[3] La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores y células huésped que comprenden los polinucleótidos al igual que métodos para producir y utilizar los polipéptidos y para usar las glucoamilasas de la invención para conversión de almidón para producir productos de fermentación, tal como etanol y jarabes, tal como glucosa. La invención también se refiere a una composición que comprende una glucoamilasa de la invención.

Descripción de las técnicas relacionadas

[4] Glucoamilasa (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) es una enzima que cataliza la liberación de D- glucosa a partir de las extremidades no-reducidas de las moléculas de oligo o polisacáridos relacionadas o de almidón. Las glucoamilasas son producidas por diferentes hongos filamentosos y levadura, siendo aquellos de Aspergillus los más importantes comercialmente.

[5] Comercialmente, las glucoamilasas se utilizan para convertir material amiláceo, que ya está parcialmente hidrolizado por una alfa-amilasa, en glucosa. La glucosa puede luego ser convertida directa o indirectamente en un producto de fermentación utilizando un organismo termentador. Ejemplos de productos de fermentación comerciales incluyen alcoholes (por ejemplo, etanol, metanol, butanol, 1,3-propanediol), ácidos orgánicos (por ejemplo, ácido cítrico, ácido acético, ácido itacónico, ácido láctico, ácido glucónico, gluconato, ácido láctico, ácido succínico, ácido 2,5-diketo- D-gluconico), cetonas (por ejemplo, acetona), aminoácidos (por ejemplo, ácido glutámico), gases (por ejemplo, H2 y CO2) y compuestos más complejos, incluyendo, por ejemplo, antibióticos (por ejemplo, penicilina y tetraciclina), enzimas, vitaminas (por ejemplo, riboflavina, B12, beta-caroteno), hormonas y otros compuestos que son difíciles de producir sintéticamente. Los procesos de fermentación se usan también comúnmente en las industrias del alcohol consumible (por ejemplo, cerveza y vino).

[6] El producto final también puede ser un jarabe. Por ejemplo, el producto final puede ser glucosa, pero también puede ser convertido, por ejemplo, por una glucosa isomerasa en fructosa o una mezcla compuesta casi igualmente de glucosa y fructosa. Esta mezcla, o una mezcla más enriquecida con fructosa, es el jarabe de maíz rico en fructosa (HFCS) usado más frecuentemente comercializado en todo el mundo.

[7] Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos que tengan actividad de glucoamilasa y polinucleótidos que codifiquen los polipéptidos y que proporcionen un rendimiento elevado en los procesos de producción del producto de fermentación, tales como los procesos de producción de etanol, incluyendo procesos de fermentación de etanol de una única fase a partir de almidón crudo no gelatinizado (o no cocinado).

[8] Uniprot: BCVJ1 divulga un polipéptido de Lacearía bicolor y la WO 26/69289 describe una glucoamilasa de Trametes cingulata.

Resumen de la invención

[9] Polipéptidos producidos por el hongo Pycnoporus sanguineus y que tienen actividad de glucoamilasa se han identificado y caracterizado.

[1] Por consiguiente, la presente invención se refiere en un primer aspecto a un polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 9%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 1% de identidad con los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID n°: 2, de SEC ID n°: 4 o de SEC ID n°: 6, (b) un polipéptido que

incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 9%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 1% de Identidad con el dominio catalítico mostrado como aminoácidos 19 a 573 de SEC ID n°: 2, SEC ID n°: 4 o de SEC ID n°: 6; (c) un pollpéptldo codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos con al menos 9%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, Incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95 tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 1% de Identidad con la secuencia codificante de SEC ID n°: 1, SEC ID n°: 3 o de SEC ID n°: 5 que codifica los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID n°: 2, SEC ID n°: 4; o de SEC ID n°: 6.

[11] La presente invención se refiere en un segundo aspecto a un polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido del primer aspecto.

[12] En otros aspectos la invención se refiere a un constructo de ácidos nucleicos, un vector de expresión recombinante, una célula huésped recombinante, una planta transgénica, una parte de planta o célula vegetal que comprende el polinucleótido del segundo aspecto.

[13] En otros aspectos, la invención se refiere a un método para producir el polipéptido, usos del pollpéptldo y una composición que incluye una alfa-amilasa y el polipéptido.

Definiciones

[14] Glucoamilasa: el término glucoamilasa (1,4-alfa-D-glucano glucohidrolasa, EC 3.2.1.3) se define como una enzima que cataliza la liberación de D-glucosa de las extremidades no reducidas de almidón o moléculas relacionadas de oligo y polisacárldos. Para fines de la presente invención, la actividad de glucoamilasa se determina según el procedimiento descrito en la sección que aparece más adelante "Materiales y Métodos".

[15] Los pollpéptldos de la presente invención tienen al menos 2%, preferiblemente al menos 4%, preferiblemente al menos 45%, de forma más preferible al menos 5%, preferiblemente al menos 55%, de forma más preferible al menos 6%, preferiblemente al menos 65%, de forma más preferible al menos 7%, preferiblemente al menos 75%, de forma más preferible al menos 8%, de forma más preferible al menos 85%, Incluso de la forma más preferible al menos 9%, de la forma más preferible al menos 95%, e incluso de la forma más preferible al menos 1% de la actividad de glucoamilasa del polipéptido maduro de SEC ID n°: 2 o una secuencia homologa del mismo, SEC ID n°: 4 o una secuencia homologa del mismo, o de SEC ID n°: 6 o una secuencia homologa del mismo, SEC ID n°: 8 o una secuencia homologa del mismo, SEC ID n°: 1 o una secuencia homologa del mismo.

[16] Polipéptido aislado: el término "polipéptido aislado", como se usa aquí, se refiere a un polipéptido que es aislado a partir de una fuente. Preferiblemente, el polipéptido es al menos 1% puro, preferiblemente al menos 5% puro, de forma más preferible al menos 1% puro, de forma más preferible al menos 2% puro,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polipéptido aislado que tiene actividad de glucoamilasa, seleccionado del grupo que consiste en:

(a) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 9%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 1% de identidad con los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID n°: 2, de SEC ID n°: 4 o de SEC ID n°: 6;

(b) un polipéptido que incluye una secuencia de aminoácidos que tiene al menos 9%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, al menos 97%, al menos 98%, al menos 99% o incluso 1% de identidad con el dominio catalítico mostrado como los aminoácidos 22 a 476 de SEC ID n°: 2, de SEC ID n°: 4 o de SEC ID n°: 6;

(c) un polipéptido codificado por un polinucleótido que comprende una secuencia de nucleótidos que tiene al menos 9%, de forma más preferible al menos 91%, de forma más preferible al menos 92%, incluso de forma más preferible al menos 93%, de la forma más preferible al menos 94%, e incluso de la forma más preferible al menos 95%, tal como al menos 96%, 97%, 98%, 99% o 1% de identidad con la secuencia codificante de SEC ID n°: 1, de SEC ID n°: 3 o de SEC ID n°: 5 que codifica los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID n°: 2, de SEC ID n°: 4 o de SEC ID n°: 6.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende o consistente en los aminoácidos 19 a 573 de SEC ID n°: 2, SEC ID n°: 4 o SEC ID n°: 6; o uno de sus fragmentos que tiene actividad de glucoamilasa.

3. Polipéptido según la reivindicación 1 o 2, que es codificado por un polinucleótido que comprende o consistente en la secuencia de nucleótidos de SEC ID n°: 1, SEC ID n°: 3 o SEC ID n°: 5; o una de sus subsecuencias que codifica un fragmento que tiene actividad de glucoamilasa.

4. Polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-3, que es codificado por el polinucleótido comprendido en el plásmido contenido en DSM 23221 de E. coli.

5. Polinucleótido aislado que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

6. Constructo de ácidos nucleicos que comprende el polinucleótido según la reivindicación 9 operativamente enlazado a una o varias (diferentes) secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped de expresión.

7. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6.

8. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos según la reivindicación 6.

9. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende: (a) cultivo de una célula huésped que comprende un constructo de ácidos nucleicos que comprende una secuencia de nucleótidos que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

1. Método para producir el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4, que comprende: (a) cultivo de una planta transgénica o una célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperación del polipéptido.

11. Planta transgénica, parte de planta o célula vegetal que comprende un polinucleótido que codifica el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

12. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para la producción de jarabe y/o un producto de fermentación.

13. Uso según la reivindicación 12, donde la materia prima es material que contiene almidón gelatinizado o no gelatinizado.

14. Uso de un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4 para elaboración de cerveza.

15. Composición que incluye una alfa-amilasa y un polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

16. Proceso de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón que consta de las siguientes etapas:

(a) licuefacción del material que contiene almidón;

(b) sacarificación del material licuado; y

(c) fermentación con un organismo de fermentación;

donde el paso (b) se realiza usando al menos una glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.

17. Proceso de producción de un producto de fermentación a partir de material que contiene almidón, que incluye las siguientes etapas:

(a) sacarificación del material que contiene almidón a una temperatura inferior a la temperatura de gelatinización inicial de dicho material que contiene almidón; y

(b) fermentación con un organismo de fermentación,

donde el paso (a) se realiza usando al menos una glucoamilasa según cualquiera de las reivindicaciones 1-4.