Polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa II y polinucleótidos para su codificación.

Polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa II, seleccionado del grupo que consiste en:



(a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 477 de la SEC ID NO:2,

(b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de identidad con el polipéptido codificado por los nucleótidos 63 a 1493 de la SEC ID NO:1,

(c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones de astringencia muy alta con,

(i) la cadena complementaria de los nucleótidos 63 a 1493 de la SEC ID NO:1,

(ii) la cadena complementaria de los nucleótidos 63 a 563 de la SEC ID NO:1, o

(iii) la cadena complementaria de los nucleótidos consistiendo en los nucleótidos 63 a 263 de SEC ID NO:1, donde condiciones de astringencia muy alta comprenden prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 1.0% SDS, 5X solución de Denhardt, 100 microg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y finalmente lavado del material portador tres veces cada vez durante 15 minutos usando 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 68ºC, o,

(d) un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad celobiohidrolasa II.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/DK2003/000914.

Solicitante: NOVOZYMES A/S.

Nacionalidad solicitante: Dinamarca.

Dirección: KROGSHOJVEJ 36 2880 BAGSVAERD DINAMARCA.

Inventor/es: LIU, YE, WU,WENPING, LANGE,LENE, SKOVLUND,DOMINIQUE,AUBERT.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • C11D3/386 QUIMICA; METALURGIA.C11 ACEITES, GRASAS, MATERIAS GRASAS O CERAS ANIMALES O VEGETALES; SUS ACIDOS GRASOS; DETERGENTES; VELAS.C11D COMPOSICIONES DETERGENTES; UTILIZACION DE UNA SOLA SUSTANCIA COMO DETERGENTE; JABON O SU FABRICACION; JABONES DE RESINA; RECUPERACION DE LA GLICERINA.C11D 3/00 Otros compuestos que entran en las composiciones detergentes cubiertas por C11D 1/00. › Preparaciones que contienen enzimas.
  • C12N9/42 C […] › C12 BIOQUIMICA; CERVEZA; BEBIDAS ALCOHOLICAS; VINO; VINAGRE; MICROBIOLOGIA; ENZIMOLOGIA; TECNICAS DE MUTACION O DE GENETICA.C12N MICROORGANISMOS O ENZIMAS; COMPOSICIONES QUE LOS CONTIENEN; PROPAGACION, CULTIVO O CONSERVACION DE MICROORGANISMOS; TECNICAS DE MUTACION O DE INGENIERIA GENETICA; MEDIOS DE CULTIVO (medios para ensayos microbiológicos C12Q 1/00). › C12N 9/00 Enzimas, p. ej. ligasas (6.); Proenzimas; Composiciones que las contienen (preparaciones para la limpieza de los dientes que contienen enzimas A61K 8/66, A61Q 11/00; preparaciones de uso médico que contienen enzimas A61K 38/43; composiciones detergentes que contienen enzimas C11D ); Procesos para preparar, activar, inhibir, separar o purificar enzimas. › actúan sobre los enlaces beta-glucosídicos-1,4, p. ej. celulasa.

PDF original: ES-2331067_T3.pdf

 


Fragmento de la descripción:

Polipéptidos con actividad celobiohidrolasa II y polinucleótidos que los codifican.

Campo de la invención

La presente invención se refiere a polipéptidos que tienen actividad celobiohidrolasa II (también referida como CBH II o CBH 2) y polinucleótidos que tienen una secuencia de nucleótidos que codifica para los polipéptidos. La invención también se refiere a constructos de ácidos nucleicos, vectores, y células huéspedes que comprenden los constructos de ácidos nucleicos al igual que métodos para producir y usar los polipéptidos.

Antecedentes de la invención

La celulosa es una materia prima industrial importante y una fuente de energía renovable. La estructura física y la morfología de la celulosa nativa son complejas y los detalles finos de su estructura han sido difíciles de determinar experimentalmente. No obstante, la composición química de la celulosa es simple, consistiendo en residuos de D-glucosa enlazados por enlaces beta-1,4-glicosídicos para formar polímeros lineales con longitud de cadenas de unos 10.000 residuos glicosídicos.

Para ser eficaz, la digestión de celulosa requiere diferentes tipos de enzimas que actúan cooperativamente. Al menos tres categorías de enzimas son necesarias para convertir la celulosa en glucosa: endo (1,4)-beta-D-glucanasas (EC 3,2,1,4) que cortan las cadenas de celulosa al azar; celobiohidrolasas (EC 3,2,1,91) que seccionan unidades de celobiosilo de las extremidades de cadena de celulosa y beta-glucosidasas (EC 3,2,1,21) que convierten celobiosa y celodextrinas solubles en glucosa. Entre estas tres categorías de enzimas implicadas en la biodegradación de celulosa, las celobiohidrolasas son las enzimas clave para la degradación de la celulosa cristalina nativa.

Exo-celobiohidrolasas (celobiohidrolasa II, o CBH II) se refieren a las celobiohidrolasas que degradan celulosa para hidrolizar la celobiosa del extremo no reducido de las cadenas poliméricas de celulosa. El grupo celobiohidrolasa II pertenece al mismo grupo EC, es decir EC 3.2.1.91, como el grupo celobiohidrolasa I, la diferencia es que la celobiohidrolasa I degrada la celulosa hidrolizando la celobiosa del extremo de reducción de las cadenas poliméricas de celulosa.

La celobiohidrolasa II y el uso de la misma son conocidas de p. ej. EERI et al (GENE. vol. 51,1, 1987, páginas 43-52), 6,114,158, WO 91/17244, EP 214 971, y EP 851 031.

Es un objeto de la presente invención proporcionar polipéptidos mejorados con actividad celobiohidrolasa II y polinucleótidos que codifican los polipéptidos. Los polipéptidos mejorados pueden tener actividad específica mejorada y/o estabilidad mejorada - en particular termostabilidad mejorada. Los polipéptidos pueden tener también una capacidad mejorada para resistir la inhibición por celobiosa.

Resumen de la invención

En un primer aspecto la presente invención se refiere a un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa II, seleccionado del grupo que consiste en: (a) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 477 de SEC ID NO:2, (b) un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de identidad con el polipéptido codificado por los nucleótidos 63 a 1493 de SEC ID NO:1, (c) un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que se híbrida bajo condiciones de astringencia muy alta, (i) la cadena complementaria de los nucleótidos 63 a 1493 de SEC ID NO:1, (ii) la cadena complementaria de los nucleótidos 63 a 563 de SEC ID NO:1, o (iii) la cadena complementaria de los nucleótidos seleccionados del grupo que consiste en los nucleótidos 63 a 263 de SEC ID NO:1, donde condiciones de astringencia muy alta comprenden prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 1.0% SDS, 5X solución de Denhardt, 100 microg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y finalmente lavado tres veces del material portador cada vez durante 15 minutos usando 0,1 X SSC, 0.1% SDS a 68ºC, o (d) un fragmento de (a) o (b) con actividad celobiohidrolasa II.

En un segundo aspecto la presente invención se refiere a un polinucleótido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido definido en el primer aspecto.

En un tercer aspecto la presente invención se refiere a un constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos definida en el segundo aspecto operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

En un cuarto aspecto la presente invención se refiere a un vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en el tercer aspecto.

En un quinto aspecto la presente invención se refiere a una célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en el tercer aspecto.

En un sexto aspecto la presente invención se refiere a un método para la producción de un polipéptido tal y como se define en el primer aspecto, el método comprendiendo: (a) cultivar una célula huésped recombinante tal y como se define en el quinto aspecto bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) recuperar el polipéptido.

En un séptimo aspecto la presente invención se refiere a un método para la producción in situ de un polipéptido tal y como se define en el primer aspecto en cualquiera de las reivindicaciones, el método comprendiendo: (a) cultivo de una célula huésped recombinante tal y como se define en el quinto aspecto bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b) puesta en contacto del polipéptido con un sustrato deseado sin recuperación previa del polipéptido.

En un octavo aspecto la presente invención se refiere a un método para redistribuir el ADN comprendiendo usar el polinucleótido tal y como se define en el segundo aspecto.

En un noveno aspecto la presente invención se refiere a un método para la producción de etanol a partir de la biomasa, comprendiendo la puesta en contacto de la biomasa con el polipéptido tal y como se define en el primer aspecto.

En un décimo aspecto la presente invención se refiere a un uso del polipéptido tal y como se define en el primer aspecto para producir etanol.

En un decimoprimer aspecto la presente invención se refiere a una planta transgénica, parte de la planta o célula vegetal, que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa II tal y como se define en el primer aspecto.

En un decimosegundo aspecto la presente invención se refiere a una composición detergente que comprende un tensioactivo y el polipéptido según cualquiera del primer aspecto.

Otros aspectos de la presente invención serán aparentes a partir de la descripción más abajo y de las reivindicaciones anexas.

Definiciones

Antes de describir la presente invención con detalles adicionales, los términos siguientes y convenciones serán definidos en primer lugar:

    Polipéptido substancialmente puro: en el contexto presente, el término "polipéptido sustancialmente puro" significa una preparación de polipéptido que contiene como máximo el 10% en peso de otro material polipeptídico con el cual está originalmente asociado (porcentajes inferiores de otro material polipeptídico son preferidos, p. ej. como mucho el 8% en peso, como mucho el 6% en peso, como mucho el 5% en peso, como mucho el 4% como mucho el 3% en peso, como mucho 2% en peso, como mucho el 1% en peso, y como mucho el 0.5% en peso). Por lo tanto, se prefiere que el polipéptido substancialmente puro tenga al menos el 92% de pureza, es decir que el polipéptido constituya al menos el 92% en peso del material polipeptídico total presente en la preparación, y porcentajes más altos son preferidos tales como al menos el 94% de pureza, al menos 95% de pureza, al menos el 96% de pureza, al menos el 96% de pureza, al menos el 97% de pureza, al menos el 98% de pureza, al menos 99%, y como mucho el 99.5% de pureza. Los polipéptidos descritos aquí están preferiblemente en una forma substancialmente pura. En particular,... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa II, seleccionado del grupo que consiste en:

(a)un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada como aminoácidos 1 a 477 de la SEC ID NO:2, (b)un polipéptido que comprende una secuencia de aminoácidos, dicha secuencia de aminoácidos tiene al menos un 90% de identidad con el polipéptido codificado por los nucleótidos 63 a 1493 de la SEC ID NO:1, (c)un polipéptido que es codificado por una secuencia de nucleótidos que se hibrida bajo condiciones de astringencia muy alta con, (i)la cadena complementaria de los nucleótidos 63 a 1493 de la SEC ID NO:1, (ii)la cadena complementaria de los nucleótidos 63 a 563 de la SEC ID NO:1, o (iii)la cadena complementaria de los nucleótidos consistiendo en los nucleótidos 63 a 263 de SEC ID NO:1,

    donde condiciones de astringencia muy alta comprenden prehibridación e hibridación a 42ºC en 5X SSPE, 1.0% SDS, 5X solución de Denhardt, 100 microg/ml de ADN de esperma de salmón cortado y desnaturalizado, y finalmente lavado del material portador tres veces cada vez durante 15 minutos usando 0,1 X SSC, 0,1% SDS a 68ºC, o, (d)un fragmento de (a) o (b) que tiene actividad celobiohidrolasa II.

2. Polipéptido según la reivindicación 1, que comprende una secuencia de aminoácidos que tiene al menos un 95% identidad con la secuencia de aminoácidos mostrada coma aminoácidos 1 a 477 de SEC ID NO:2,

3. Polinucleátido que tiene una secuencia de nucleótidos que codifica para el polipéptido definido en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

4. Constructo de ácidos nucleicos que comprende la secuencia de nucleótidos definida en la reivindicación 3 operativamente enlazada a una o más secuencias de control que dirigen la producción del polipéptido en un huésped adecuado.

5. Vector de expresión recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 4.

6. Célula huésped recombinante que comprende el constructo de ácidos nucleicos definido en la reivindicación 4.

7. Método para la producción de un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, el método comprendiendo:

(a)cultivo de una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 6 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b)recuperación del polipéptido.

8. Método para producción in situ de un polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2, el método comprendiendo:

(a)cultivo de una célula huésped recombinante tal y como se define en la reivindicación 6 bajo condiciones propicias para la producción del polipéptido; y (b)puesta en contacto del polipéptido con un sustrato deseado sin recuperación previa del polipéptido.

9. Método para redistribuir ADN comprendiendo el uso del polinucleótido tal y como se define en la reivindicación 3.

10. Método para la producción de etanol a partir de biomasa, comprendiendo la puesta en contacto de la biomasa con el polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

11. Uso del polipéptido tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2 para producir etanol.

12. Planta transgénica, parte de planta o célula de planta, que ha sido transformada con una secuencia de nucleótidos que codifica un polipéptido que tiene actividad celobiohidrolasa II tal y como se define en cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.

13. Composición detergente que comprende un tensioactivo y el polipéptido según cualquiera de las reivindicaciones 1 o 2.


 

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