POLIPÉPTIDOS RELACIONADOS CON EL COPOLÍMERO 1 PARA SU USO COMO MARCADORES DE PESOS MOLECULARES Y PARA USO TERAPÉUTICO.

Polipéptidos relacionados con el copolímero 1 para su uso como marcadores de pesos moleculares y para uso terapéutico INTRODUCCIÓN La presente invención proporciona marcadores de pesos moleculares para la determinación precisa del peso molecular del acetato de glatirámero, de terpolímeros y otros copolímeros. Los marcadores de pesos moleculares son polipéptidos que tienen pesos moleculares identificados entre 3757 Daltons y 11.727 Daltons, y una composición de aminoácidos que se corresponde con el acetato de glatirámero o con un copolímero relacionado. Los pesos moleculares identificados se proporcionan mediante polipéptidos que tienen secuencias definidas. Los marcadores de pesos moleculares que se corresponden con el acetato de glatirámero comprenden los aminoácidos alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina en relaciones molares específicas. Los marcadores de pesos moleculares correspondientes a terpolímeros relacionados comprenden tres de los cuatro aminoácidos. En una forma de realización preferida, el polipéptido tiene alanina en el extremo N-terminal y tirosina en la cuarta posición desde el extremo N-terminal. La presente invención proporciona adicionalmente una pluralidad de marcadores de pesos moleculares para la determinación del intervalo de pesos moleculares de una composición copolimérica. La pluralidad de marcadores de pesos moleculares idealmente presenta relaciones lineales entre la elipticidad molar y el peso molecular, o entre el tiempo de retención y el log del peso molecular. ANTECEDENTES DE LA INVENCIÓN El acetato de glatirámero (Copolímero 1; Cop 1; en lo sucesivo copolímero GLAT) es una mezcla de polipéptidos 25 compuestos de alanina, ácido glutámico, lisina, y tirosina en una relación molar de aproximadamente 4,6:1,5:3,6:1,0, respectivamente, que se sintetiza polimerizando químicamente los cuatro aminoácidos, formando productos con pesos moleculares medios que abarcan entre 4000 aproximadamente y 13.000 Daltons aproximadamente. Las fracciones molares correspondientes son de 0,427 para la alanina, 0,141 para el ácido glutámico, 0,337 para la lisina y 0,093 para la tirosina, aproximadamente, y pueden variar en un ±10% aproximadamente. Los intervalos de pesos moleculares medios 30 preferidos y los procedimientos de preparación de terpolímeros se describen en la patente de EE.UU. Nº 5.800.808.   Para certificar la preparación del Copolímero 1 o de un terpolímero para su uso en productos farmacéuticos, es necesario determinar con precisión la distribución de pesos moleculares de los polipéptidos en la preparación. Un procedimiento para determinar el peso molecular es cromatografía en una columna de Superosa 12. Los coeficientes de calibración de columnas para la determinación del peso molecular del acetato de glatirámero se han determinado usando lotes de acetato de glatirámero con pesos moleculares medidos indirectamente. Las medidas indirectas han incluido la viscosimetría y la velocidad de sedimentación por ultracentrifugación. Más recientemente, se han preparado lotes de marcadores de acetato de glatirámero, cuyos pesos moleculares se determinaron por dispersión de luz láser en múltiples ángulos (MALLS). Así, existe una necesidad de marcadores de pesos moleculares útiles como patrones para la determinación de la distribución de pesos moleculares de composiciones copoliméricas contempladas por la invención. Los marcadores de pesos moleculares deseables tienen pesos moleculares y propiedades físicas definidos que son análogos a las moléculas para las cuales se va a determinar el peso molecular. Idealmente, hay una relación lineal entre los pesos moleculares definidos (o el log de los pesos moleculares definidos) de los marcadores y una propiedad física medible tal como, por ejemplo, la elipticidad molar de los marcadores, o el tiempo de retención de los marcadores en una columna de separación por tamaño molecular. RESUMEN DE LA INVENCIÓN Los marcadores de pesos moleculares de secuencia definida que tienen características químicas y físicas similares al copolímero GLAT proporcionan una calibración precisa y robusta ajustada para determinaciones del peso molecular de lotes de producción. La presente invención revela derivados del copolímero GLAT útiles como marcadores de pesos moleculares para la determinación de los intervalos de pesos moleculares de preparaciones de copolímero GLAT. Estos polipéptidos corresponden a las SEQ. NO. 1-7 tal y como se describe. Para la determinación del intervalo de pesos moleculares de una preparación de copolímero GLAT, el derivado preferido es un polipéptido que tiene una composición de aminoácidos que se corresponde aproximadamente con el copolímero GLAT y un peso molecular identificado que está entre 3757 Daltons y 11.727 Daltons. El polipéptido tiene relaciones molares específicas de los aminoácidos alanina, ácido glutámico, tirosina y lisina. Además, en una forma de realización preferida el polipéptido tiene alanina en el extremo N-terminal y tirosina en la cuarta posición desde el extremo N-terminal. Para la determinación del peso molecular de un terpolímero, el derivado preferido tendrá un peso molecular definido y una composición de aminoácidos que se corresponde aproximadamente con aquélla del terpolímero. Otros copolímeros también están contemplados por la invención. Cuando se determina el peso molecular de un copolímero contemplado por la invención, el derivado del polipéptido tendrá un peso molecular definido y una composición de aminoácidos que se corresponde aproximadamente 2 con aquélla del copolímero. La presente invención proporciona adicionalmente una pluralidad de marcadores de pesos moleculares para la determinación del peso molecular del acetato de glatirámero o de un terpolímero u otro copolímero en una columna de separación de pesos moleculares. Los marcadores comprenden de dos a siete o más polipéptidos, cada polipéptido con un peso molecular identificado. Cuando se determina el intervalo de pesos moleculares del acetato de glatirámero, una pluralidad preferida de marcadores de pesos moleculares tendrán pesos moleculares definidos desde 3757 Daltons hasta 11.727 Daltons, y una composición de aminoácidos correspondiente al acetato de glatirámero o a un terpolímero seleccionado. En formas de realización preferidas, hay una relación lineal entre el log del peso molecular de los marcadores de pesos moleculares polipeptídicos y el tiempo de retención de los marcadores de pesos moleculares en la columna de separación por tamaños o entre el peso molecular de los marcadores de pesos moleculares y la elipticidad molar de los marcadores de pesos moleculares. BREVE DESCRIPCIÓN DE LOS DIBUJOS 15 La Figura 1a proporciona la distribución de la alanina en los marcadores moleculares (marcadores TV) descritos en la Tabla 1. La posición del aminoácido está definida por el eje X. La presencia de una alanina está indicada por una barra vertical en la posición del aminoácido indicado. La Figura 1b proporciona la distribución de la lisina en los marcadores TV descritos en la Tabla 1. La posición del 20 aminoácido está definida por el eje X. La presencia de un resto de lisina está indicada por una barra vertical en la posición del aminoácido indicado. La Figura 1c proporciona la distribución del ácido glutámico en los marcadores TV descritos en la Tabla 1. La posición del aminoácido está definida por el eje X. La presencia de un resto de ácido glutámico está indicada por una barra vertical en la posición del aminoácido indicado. La Figura 1d proporciona la distribución de la tirosina en los marcadores TV descritos en la Tabla 1. La posición del aminoácido está definida por el eje X. La presencia de un resto de tirosina está indicada por una barra vertical en la posición del aminoácido indicado. La Figura 2 proporciona una gráfica de la elipticidad molar frente al peso molecular de los presentes marcadores TV comparados con marcadores de acetato de glatirámero conocidos. La elipticidad molar se proporciona en 10 -5 grad cm -2 dmol -1 y el peso molecular está en Daltons. Los círculos indican marcadores TV y los cuadrados representan marcadores de acetato de glatirámero. Como se muestra, los marcadores TV proporcionan una relación lineal entre la elipticidad molar y el peso molecular. La Figura 3a proporciona una gráfica del tiempo de retención relativo (TRR) de los presentes marcadores TV frente al log del peso molecular de esos marcadores, usando un algoritmo basado en el TRR. 40 La Figura 3b proporciona una gráfica del log del peso molecular de los marcadores TV frente al tiempo de retención (TR) de esos marcadores, usando un algoritmo basado en Millennium.   La Figura 4a proporciona una gráfica que resume diversas calibraciones del tiempo de retención relativo (TRR) de los marcadores... [Seguir leyendo]

1. Un polipéptido que tiene una secuencia de aminoácidos expuesta en la SEQ ID NO: 1, SEQ ID NO: 2, SEQ ID NO: 3, SEQ ID NO: 4, SEQ ID NO: 5, SEQ ID NO: 6, o SEQ ID NO: 7. 2. El polipéptido de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos está expuesta en la SEQ ID NO: 1. 3. El polipéptido de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos está expuesta en la SEQ ID NO: 2. 4. El polipéptido de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos está expuesta en la SEQ ID NO: 3. 5. El polipéptido de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos está expuesta en la SEQ ID NO: 4. 6. El polipéptido de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos está expuesta en la SEQ ID NO: 5. 7. El polipéptido de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos está expuesta en la SEQ ID NO: 6. 8. El polipéptido de la reivindicación 1, cuya secuencia de aminoácidos está expuesta en la SEQ ID NO: 7. 20 9. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el polipéptido consta exclusivamente de Laminoácidos.   10. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-8, en el que el polipéptido consta exclusivamente de Daminoácidos. 11. El polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 para su uso en la determinación del peso molecular medio del acetato de glatirámero. 12. Un procedimiento para la determinación del peso molecular medio del acetato de glatirámero que 30 comprende la calibración de un aparato cromatográfico que se usa para la determinación del peso molecular con el polipéptido de cualquiera de las reivindicaciones 1-10 y la determinación del peso molecular medio del acetato de glatirámero usando el aparato cromatográfico calibrado que se usa para la determinación del peso molecular. 17   Distribución de L-alanina en los marcadores TV FIGURA 1a-1 L-alanina 18   FIGURA 1a-2 19     21   22   23   24     26   27   28   29     31   32   33