Polipéptidos recombinantes de los miembros de la familia de ligandos de TNF y su utilización.

Procedimiento para la depleción y/o eliminación extracorporal de receptores del factor de necrosis tumoral(TNFR) de la sangre o fracciones sanguíneas,

que comprende las etapas siguientes:

a) eventualmente, separar la sangre en una o varias fracciones con componentes sólidos y/o líquidos;

b) unir la sangre o las fracciones sanguíneas a una partícula o superficie acoplada con un polipéptido,comprendiendo el polipéptido por lo menos tres componentes A y por lo menos dos componentes B, siendocada componente A un monómero de TNF o un fragmento y/o una variante del mismo, que presenta unapropiedad de unión y trimerización, y siendo cada componente B un ligante peptídico, y

c) separar el TNFR unido.

Tipo: Patente Internacional (Tratado de Cooperación de Patentes). Resumen de patente/invención. Número de Solicitud: PCT/EP2005/003158.

Solicitante: UNIVERSITAT STUTTGART.

Nacionalidad solicitante: Alemania.

Dirección: KEPLERSTRASSE 7 70174 STUTTGART ALEMANIA.

Inventor/es: Pfizenmaier,Klaus, Scheurich,Peter, GRUNWALD,INGO, KRIPPNER-HEIDENREICH,ANJA.

Fecha de Publicación: .

Clasificación Internacional de Patentes:

  • A61K38/00 NECESIDADES CORRIENTES DE LA VIDA.A61 CIENCIAS MEDICAS O VETERINARIAS; HIGIENE.A61K PREPARACIONES DE USO MEDICO, DENTAL O PARA EL ASEO (dispositivos o métodos especialmente concebidos para conferir a los productos farmacéuticos una forma física o de administración particular A61J 3/00; aspectos químicos o utilización de substancias químicas para, la desodorización del aire, la desinfección o la esterilización, vendas, apósitos, almohadillas absorbentes o de los artículos para su realización A61L; composiciones a base de jabón C11D). › Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00).
  • A61K38/19 A61K […] › A61K 38/00 Preparaciones medicinales que contienen péptidos (péptidos que contienen ciclos beta-lactama A61K 31/00; dipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina 2,5-dionas, A61K 31/00; péptidos basados en la ergolina A61K 31/48; que contienen compuestos macromoleculares que tienen unidades aminoácido repartidas estadísticamente A61K 31/74; preparaciones medicinales que contienen antígenos o anticuerpos A61K 39/00; preparaciones medicinales caracterizadas por los ingredientes no activos, p. ej. péptidos como soportes de fármacos, A61K 47/00). › Citoquinas; Linfoquinas; Interferones.
  • A61K45/06 A61K […] › A61K 45/00 Preparaciones medicinales que contienen ingredientes activos no previstos en los grupos A61K 31/00 - A61K 41/00. › Mezclas de ingredientes activos sin caracterización química, p. ej. compuestos antiflojísticos y para el corazón.
  • C07K14/525 QUIMICA; METALURGIA.C07 QUIMICA ORGANICA.C07K PEPTIDOS (péptidos que contienen β -anillos lactamas C07D; ipéptidos cíclicos que no tienen en su molécula ningún otro enlace peptídico más que los que forman su ciclo, p. ej. piperazina diones-2,5, C07D; alcaloides del cornezuelo del centeno de tipo péptido cíclico C07D 519/02; proteínas monocelulares, enzimas C12N; procedimientos de obtención de péptidos por ingeniería genética C12N 15/00). › C07K 14/00 Péptidos con más de 20 aminoácidos; Gastrinas; Somatostatinas; Melanotropinas; Sus derivados. › Factor de necrosis tumoral (TNF).
  • C07K14/705 C07K 14/00 […] › Receptores; Antígenos celulares de superficie; Determinantes celulares de superficie.

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Polipéptidos recombinantes de los miembros de la familia de ligandos de TNF y su utilización.

Fragmento de la descripción:

Polipéptidos recombinantes de los miembros de la familia de ligandos de TNF y su utilización.

La presente invención se refiere a procedimientos para la manipulación, depleción y/o eliminación extracorporal de componentes contenidos en los líquidos corporales, por ejemplo por medio de aféresis.

En el caso de los miembros de la familia de ligandos de TNF se trata de citocinas proinflamatorias. Las citocinas en general y los miembros de la familia de ligandos de TNF en particular desempeñan un papel importante en la estimulación y coordinación del sistema inmunitario innato así como de la respuesta inmunitaria humoral (mediada por anticuerpos) , en la inducción de apoptosis, en la creación de huesos, en la formación de los soportes estructurales para el crecimiento de pelo, el crecimiento de los dientes y el desarrollo de las glándulas sudoríparas, el soporte estructural de ganglios linfáticos y muchos más (Aggarwal, B.B. (2003) , Nat. Rev. Immunol. 3, 745-756) . Por el contrario, una regulación deficiente de los miembros de la familia de ligandos de TNF puede conducir a numerosos estados patológicos. A éstos pertenecen, por ejemplo, el choque septicémico, enfermedades autoinmunitarias, tales como artritis reumatoide, o enfermedades neurodegenerativas. El factor de necrosis tumoral (TNF) es el miembro que da nombre y probablemente el más importante de esta gran familia de citocinas.

Los miembros de la familia de ligandos de TNF despliegan su acción en su forma biológicamente activa como homotrímeros (Banner, D.W. et al, (1993) Cell 73, 431-445) . Las estructuras triméricas y también las agregaciones de orden superior (por ejemplo oligómeros o multímeros de trímeros) de proteínas pueden encontrarse en gran número en la naturaleza. Ejemplos son la proteína de matriz del cartílago (CMP) , una proteína del tejido conjuntivo (Beck et al (1996) , J Mol Biol 256, 909-923) , proteínas de la familia del colágeno, tal como la familia Clq, a la que pertenecen Clq, colágeno α1 (X) , α2 (VII) , la proteína específica de la hibernación, ACRP30, la proteína de la estructura interna del oído, celebrina y multimerina (Kishore y Reid, (1999) , Immunopharmacol. 42, 15-21) , y proteínas de la familia de la colectina, tal como la proteína surfactante pulmonar A (SP-A) y la proteína de unión a manosa (MBP) (Epstein et al. (1996) , Current Opinion in Immunology, vol. 8 n.º 1, 29-35) .

La disposición conjunta de proteínas para dar un trímero tiene lugar en las superficies de estas proteínas que se trimerizan en disolución debido a interacciones, tales como interacciones hidrófobas, uniones por puente de hidrógeno, uniones covalentes (por ejemplo puentes disulfuro) y/o fuerzas de Coulomb, pero también debido a motivos estructurales, es decir secuencias de aminoácidos características, que provocan una formación de superestructuras secundarias intermoleculares. En el caso de los miembros de la familia de ligandos de TNF, los tres monómeros se mantienen juntos en la estructura homotrimérica de manera no covalente a través de uniones hidrófobas. En su forma activada activan a su vez los miembros de la familia de receptores de TNF opuestos a ellos, que como tales no presentan actividad enzimática. Por ejemplo, el TNF, como miembro de la familia de ligandos de TNF, se une a los dos receptores de membrana TNFR1 y TNFR2 y facilita la trimerización o la activación de receptores que se encuentran ya en forma de trímeros, pero inactivos desde el punto de vista de las señales. Mediante la formación de complejos de los receptores se inicia una cascada de señales con la que, entre otros, va acompañada una asociación de proteínas adaptadoras citoplasmáticas (Wajant, H. et al (2003) , Cell Death, Differ, 10, 45-65) . La estructura trimérica de TNFR1 y TNFR2 se presenta de tal manera que los receptores se unen en cada caso en el intersticio entre dos de los tres monómeros de TNF del homotrímero de TNF (Banner et al (1993) citado anteriormente) . De esto resulta evidente que tanto el TNF como los otros miembros de la familia de ligandos de TNF sólo son biológicamente activos en su estructura como homotrímero.

Debido a su función, los miembros der familia de ligandos de TNF o sus receptores de membrana pueden utilizarse de múltiples maneras para el tratamiento de numerosas enfermedades, tales como enfermedades infecciosas e inflamatorias, enfermedades metabólicas, enfermedades que se deben a una regulación deficiente de la apoptosis, enfermedades neurodegenerativas y muchas otras enfermedades. Un papel especialmente importante lo desarrolla su utilización en el tratamiento de enfermedades cancerosas, dado que en el caso de los miembros de la familia de ligandos de TNF se trata en general de sustancia de acción antitumoral. En este contexto pueden mencionarse en particular el propio TNF (Eggermont, A.M. y ten Hagen, T.L. (2003) , Curr. Oncol. Rep. 5, 79-80) , TRAIL (TNF related apoptoses inducing ligand, ligando que produce apoptosis relacionadas con TNF) , también denominado Apo 2L (Weley et al. (1995) , Immunity 6: 673-682; Petti et al (1996) J Biol Chem 271: 12687-12689) y FasL. Sin embargo, estudios in vivo mostraron fuertes efectos secundarios sistémicos en el caso del TNF y agonistas del receptor Fas y estudios in vitro indican también efectos tóxicos similares en determinadas preparaciones de TRAIL (Jo et al. (2000) Nat Med 6: 564-567, Ichikawa et al (2001) Nat Med 7: 954-960; Ogasawara et al. (1993) Nature 364: 806-809) . Por ejemplo, anticuerpos agonistas mostraron contra Fas, el receptor de FasL, un efecto extremadamente hepatotóxico (Ogasawara et al. (1993) citado anteriormente) . Por tanto, en el caso de ligandos/agonistas que activan Fas se ha descartado por el momento una aplicación clínica por motivos de seguridad. No obstante, debido a la gran importancia de TNF, TRAIL, FasL y otros miembros de la familia de ligandos de TNF en este campo y los efectos secundarios asociados con su aplicación en forma de una administración sistémica clínica, se han seguido varios enfoques para minimizar estos efectos secundarios (Eggermont, A.M. y ten Hagen, T.L. (2003) , Curr. Oncol. Rep. 5, 79-80) .

Así, por ejemplo el documento WO 02/22680 describe proteínas de fusión, que posibilitan un efecto dirigido y

específico de tejido o de célula de las citocinas mediante la fusión de la citocina con un anticuerpo de unión a antígeno. De esta manera se consigue que las citocinas no desplieguen ninguna acción sobre tejidos o células que no entran en contacto con estas proteínas de fusión y que se reduzcan los efectos secundarios sobre estos tejidos o células.

En el documento DE 102 47 755 se da a conocer un sistema independiente de anticuerpos, que posibilita igualmente una acción dirigida y específica de tejido o de célula de las citocinas. En este caso se trata de proteínas de fusión, en las que la activación de un tramo de proteína contenido en las mismas con función biológica tiene lugar a través de su unión a un dominio de unión de moléculas de la superficie celular, que representa un tramo de proteína adicional de la proteína de fusión. Además de una reducción de los efectos secundarios en los tejidos no diana, este sistema puede utilizarse ventajosamente también para moléculas de la superficie celular en las células diana para las que no hay anticuerpos o hay anticuerpos con una especificidad demasiado reducida.

Sin embargo, además de los efectos secundarios mencionados también es extremadamente problemático el hecho de que los homotrímeros activos de los miembros de la familia de ligandos de TNF se disocian en diluciones, es decir también en el caso de concentraciones fisiológicamente útiles. Si bien esta disociación es básicamente reversible, sin embargo la proteína pierde rápidamente su bioactividad, dado que se desnaturaliza. Se supone que esta desnaturalización tiene lugar a lo largo de la etapa de los monómeros inestables (Smith, R.A. y Baglioni, C. (1987) , J. Biol. Chem. 262, 6951-6954; Narhi, LO. y Arakawa, T. (1987) , Biochem. Biophys. Res. Commun 147, 740746) .

Debido a observaciones correspondientes en el caso de TRAIL, que presenta una labilidad especial, se intentó superar la estabilidad de la proteína agregando una cremallera de leucina como módulo de trimerización (Cha, S.S. et al., (1999) , Immunity. 11, 253-261) . En el estado natural, TRAIL se estabiliza mediante un ión zinc, que se encuentra en el centro del ligando trimérico, y que se coordina mediante restos cisteína (Hymowitz, S.G. et al. (2000) , Biochemistr y 39, 633-640) . Sin embargo, en este caso puede ser desventajoso que mediante la agregación de la cremallera de leucina no sólo se consiga un aumento de estabilidad, sino que también se vean... [Seguir leyendo]

 


Reivindicaciones:

1. Procedimiento para la depleción y/o eliminación extracorporal de receptores del factor de necrosis tumoral (TNFR) de la sangre o fracciones sanguíneas, que comprende las etapas siguientes:

a) eventualmente, separar la sangre en una o varias fracciones con componentes sólidos y/o líquidos;

b) unir la sangre o las fracciones sanguíneas a una partícula o superficie acoplada con un polipéptido, comprendiendo el polipéptido por lo menos tres componentes A y por lo menos dos componentes B, siendo 10 cada componente A un monómero de TNF o un fragmento y/o una variante del mismo, que presenta una propiedad de unión y trimerización, y siendo cada componente B un ligante peptídico, y

c) separar el TNFR unido.

2. Procedimiento según la reivindicación 1, en el que los componentes A son idénticos o diferentes.

3. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes A proceden del mismo organismo o de organismos diferentes.

4. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes B enlazan, respectivamente, dos de dichos por lo menos tres componentes A entre sí.

5. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que por lo menos uno de los componentes B

presenta la secuencia de aminoácidos (GGGS) 3 o (GGGS) 4. 25

6. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes A y los componentes B forman una estructura proteica trimérica.

7. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los componentes A y los componentes B forman una 30 estructura proteica homotrimérica.

8. Procedimiento según la reivindicación 6, en el que los componentes A y los componentes B forman una estructura proteica heterotrimérica.

9. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes B son idénticos o diferentes.

10. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que los componentes B proceden del mismo organismo o de organismos diferentes. 40

11. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido presenta una secuencia de etiqueta, preferentemente N-terminal, en particular una secuencia de etiqueta de His o una secuencia de etiqueta Flag.

12. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido presenta una secuencia peptídica líder, preferentemente N-terminal.

13. Procedimiento según una de las reivindicaciones anteriores, en el que el polipéptido contiene por lo menos un componente C adicional, que es un fragmento de anticuerpo u otra proteína o péptido, que reconoce selectivamente 50 una molécula diana específica sobre una superficie celular.

14. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el componente C es un fragmento de anticuerpo de un mamífero, en particular de origen murino o humano, o un fragmento de anticuerpo humanizado.

15. Procedimiento según la reivindicación 13 o 14, en el que el fragmento de anticuerpo puede estar presente en diferentes formatos de anticuerpo, por ejemplo como scFv, en particular scFv40.

16. Procedimiento según la reivindicación 13, en el que el componente C es una proteína o un péptido con especificidad para una molécula de la superficie celular, en particular un receptor de citocinas, un receptor de factor 60 de crecimiento, una integrina o una molécula de adhesión celular.

17. Procedimiento según la reivindicación 16, en el que el receptor de citocinas se selecciona de entre el grupo de la familia de genes de TNFR.


 

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